阴道毛滴虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶（Tv-CatD）受铁在不同水平的调控

《BioMetals》：Trichomonas vaginalis cathepsin D-like aspartic proteinase (Tv-CatD) is regulated by iron at different levels

　　

摘要

在感染期间，阴道毛滴虫暴露于pH、温度以及铁、葡萄糖、多胺和锌浓度的微环境变化中。铁或葡萄糖等环境因素可影响包括蛋白酶在内的一些毒力因子的表达。组织蛋白酶D是一种天冬氨酸蛋白酶，此前已被表征并发现受葡萄糖正调控。然而，研究人员尚不清楚铁是否也能调节该蛋白酶。因此，本研究旨在分析铁对Tv-CatD表达、分泌和蛋白水解活性的影响。RT-qPCR分析显示，在铁限制（iron restriction, IR）或高铁（high iron, HI）条件下生长的寄生虫，其tv-catd在转录水平的表达没有变化。然而，Western blot（WB）分析显示，HI条件下Tv-CatD蛋白量约为IR条件下的2.6倍。此外，体外分泌实验随后经WB和间接免疫荧光分析显示，Tv-CatD以时间依赖性方式分泌，其向寄生虫表面的动员似乎通过囊泡发生，主要是在HI条件下。有趣的是，HI条件下分泌型Tv-CatD的蛋白水解活性比IR条件下低约4.7倍。这些结果以及在不同铁浓度存在下的抑制实验表明，Fe²⁺可作为阴道毛滴虫中Tv-CatD酶活性的另一种特异性抑制剂。研究结果表明，铁在转录后水平（可能通过RNA-蛋白质复合物）和翻译后水平（可能通过直接结合催化结构域）差异性地调控Tv-CatD。

论文解读：铁对阴道毛滴虫Tv-CatD的多水平调控

**一、研究背景与科学问题**

滴虫病是全球最常见的非病毒性性传播感染，由鞭毛原生动物寄生虫阴道毛滴虫（*Trichomonas vaginalis*）引起。世界卫生组织数据显示，2020年全球约有1.563亿新发病例。尽管滴虫病通常为慢性、无症状且非致死性感染，但它是其他健康问题的危险因素，包括增加HIV感染和传播的风险、与HPV感染相关，并与宫颈癌和前列腺癌存在关联。此外，阴道毛滴虫还可引起结膜炎和新生儿呼吸道感染等并发症。

阴道毛滴虫利用多种毒力特性定植于人体组织，包括粘蛋白溶解活性、细胞粘附、吞噬作用、溶血和细胞毒性等。其分子发病机制是多因素的，涉及多种毒力因子，如至少五种粘附素、磷脂酶、粘蛋白酶、脂聚糖、孔蛋白、蛋白酶和细胞外囊泡等。在月经周期中，阴道毛滴虫经历pH、温度以及铁、葡萄糖、锌和多胺等微环境因素的变化，这些因素差异性调节某些毒力因子的基因表达。

铁是所有生物体（包括单细胞和多细胞生物）的必需元素，在生物化学、生长和发育中发挥关键作用。铁是细胞色素、乌头酸酶和聚合酶等酶的辅因子，参与DNA修复和合成、能量代谢、氧运输和储存等过程。在病原生物中，铁对生长、毒力和其他生物学功能至关重要。在阴道毛滴虫中，铁差异性调节多种半胱氨酸蛋白酶（CPs）的表达，如TvCP39、TvCP4、TvCP2、TvCP30、TvCP12和TvLEGU-1等。此外，葡萄糖对TvLEGU-2、TvLEGU-1、TvTIM和Tv-CatD等分子表达的影响也已被描述。

先前的研究已表征了一种毛滴虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶Tv-CatD。完整的tv-catd基因（TVAG_336300）编码约41 kDa的前体组织蛋白酶D样蛋白酶（酶原），其N端1至56位氨基酸的前肽区域在蛋白酶成熟过程中被去除，产生约35 kDa的成熟Tv-CatD。Tv-CatD还存在约30 kDa和约25 kDa的其他形式，可能对应于加工或降解形式。Tv-CatD在转录和蛋白质水平上受葡萄糖正调控，在溶酶体、细胞质、内质网（ER）、高尔基体（G）和细胞核等多个亚细胞区域显示多种定位。其最适蛋白水解活性发生在pH 4.5，不被胃蛋白酶抑制剂A抑制，但可被铜抑制。体外分泌实验显示阴道毛滴虫在不同葡萄糖浓度下生长时会分泌Tv-CatD。二维酶谱分析表明Tv-CatD在葡萄糖限制和高葡萄糖条件下均能降解人血红蛋白（Hb）。

然而，铁是否能影响Tv-CatD的表达、分泌和蛋白水解活性仍不清楚，因为感染期间寄生虫在月经周期中会经历铁浓度的变化。因此，本研究旨在分析铁对Tv-CatD表达、定位和分泌的影响，并探讨铁在Tv-CatD酶活性中的直接作用。

**二、主要技术方法**

研究使用了阴道毛滴虫CNCD 188临床分离株，在铁限制（IR）和高铁（HI）条件下培养。采用的实验方法包括：RT-qPCR检测tv-catd转录水平；Western blot（WB）分析Tv-CatD蛋白量；间接免疫荧光（IFA）结合共聚焦显微镜观察亚细胞定位及表面定位；LysoTracker标记溶酶体定位；细胞分级分离验证蛋白分布；体外分泌实验及分泌动力学分析；荧光底物酶活性测定评估蛋白水解活性；分子对接模拟Fe²⁺与Tv-CatD催化位点的相互作用。此外还进行了铁浓度梯度抑制实验和二价阳离子特异性分析。

**三、研究结果**

**1. tv-catd mRNA 5‘-UTR存在推定IRE样茎环结构**

对tv-catd基因5’和3‘调控区的计算机分析显示，tv-catd的5’调控区缺乏ap65基因中描述的铁调控启动子元件以及MRE?1、MRE?2r和MRE?2f基序。相反，tv-catd mRNA可在5’-UTR形成非典型的IRE样茎环结构（ΔG = ?2.4 kcal/mol），但在3‘-UTR未发现，提示tv-catd可能存在转录后水平的正调控。

**2. 铁不影响tv-catd转录本表达**

RT-qPCR分析显示，在不同铁条件下培养的寄生虫中，tv-catd mRNA水平无显著差异，表明铁在转录水平不显著影响tv-catd表达，这与转录后水平正调控的预期一致。

**3. 铁增加Tv-CatD蛋白量**

WB分析显示，抗rTv-CatD抗体识别到约35 kDa的成熟Tv-CatD蛋白带，HI条件下该条带强度高于IR条件。光密度分析证实，HI条件下Tv-CatD蛋白量约为IR条件下的2.6倍（P <0.0001），表明铁在蛋白质水平正调控Tv-CatD，支持该基因存在转录后水平的铁正调控。

**4. 铁对Tv-CatD定位的影响**

IFA实验显示，在非透化寄生虫中，IR条件下Tv-CatD在寄生虫表面呈稀少点状分布，而HI条件下点状定位更丰富，集中在寄生虫膜的极化区域。在透化寄生虫中，IR条件下Tv-CatD分散在细胞质和小囊泡中，而HI条件下Tv-CatD在各种大小的囊泡中丰富分布，荧光强度更高。LysoTracker双标实验显示铁不影响Tv-CatD的溶酶体定位。细胞分级分离实验证实Tv-CatD在IR和HI条件下均存在于细胞质和膜富集组分中，而成熟形式（约35 kDa）在HI条件下还见于可溶性核组分。HI条件下成熟蛋白条带强度更高，与此前的蛋白质水平正调控结果一致。

**5. Tv-CatD在两种铁条件下均由活的代谢活跃寄生虫分泌**

体外分泌实验表明，寄生虫在分泌实验期间保持活性（活力约97-99%）。WB分析显示在HI条件下分泌的Tv-CatD蛋白多于IR条件，光密度分析差异显著（P <0.05）。分泌产物中检测到约35 kDa和约30 kDa条带，分别对应于成熟和加工形式的Tv-CatD。这些数据表明Tv-CatD在两种铁条件下均由寄生虫分泌，且HI条件下分泌量更大。

**6. Tv-CatD可能通过囊泡以时间依赖性方式动员分泌**

分泌动力学分析显示，Tv-CatD分泌呈时间依赖性，条带强度随时间逐渐增加。双步IFA揭示分泌囊泡的动力学过程：在0分钟时Tv-CatD在细胞质和小囊泡中检测到，靠近膜区域极化；15分钟后表面区域标记增加，含有Tv-CatD的囊泡数量增多；30和45分钟时Tv-CatD标记集中在囊泡中，与分泌囊泡的共定位增加；60分钟时Tv-CatD再次出现在囊泡和斑块样区域。WB和IFA结果表明Tv-CatD以时间依赖性方式分泌，其分泌动员似乎通过囊泡进行。

**7. 铁下调PREs和SPs中Tv-CatD的蛋白水解活性**

酶活性分析显示，尽管使用相同量的PRE，IR条件下生长的寄生虫中Tv-CatD活性意外地高于HI条件（P <0.0001）。条件转换实验显示，从IR转换至HI或从HI转换至IR后，Tv-CatD活性无统计学显著差异，表明铁对Tv-CatD活性的抑制作用是可逆的。SPs的活性分析同样显示IR条件下的酶活性高于HI条件（P <0.0001）。这提示培养介质中的铁可能在生长过程中抑制Tv-CatD活性。

**8. 铁抑制Tv-CatD的蛋白水解活性**

分子对接分析表明，Fe²⁺可与Tv-CatD催化位点的两个天冬氨酸残基（D20和D205）相互作用，距离<5 ?，涉及8个残基（P19、D20、T21、G22、L204、D205、T206和G207）。铁浓度梯度实验显示，IR条件下Tv-CatD活性在0.25 mM铁时开始下降，HI条件下在0.5 mM时出现抑制效应，随铁浓度增加活性持续下降，10 mM时两种条件下活性完全丧失。阳离子特异性分析显示，Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺和Mg²⁺不抑制Tv-CatD活性，Zn²⁺具有与铁相似的抑制作用，而单价离子K⁺和Na⁺不抑制活性。这些结果表明Fe²⁺可作为Tv-CatD的特异性抑制剂，类似于此前报道的Cu²⁺。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，铁对阴道毛滴虫具有多效性影响，包括维持典型滋养体形态、改变某些蛋白质的量以及改变转录和酶活性水平。本研究首次证明铁能在同一分子中同时在转录后水平和翻译后水平进行调控。

在转录后调控方面，tv-catd基因缺乏铁调控启动子元件，但在5‘-UTR存在非典型IRE样茎环结构（含原生动物特异性GUU基序而非共有CAGUGN序列），类似于TvCP4的正调控机制。研究人员提出铁可能通过平行的IRE/IRP样系统介导转录后调控，但需进一步功能实验证实特异性RNA-蛋白质复合物的形成。

在翻译后调控方面，分子对接提示Fe²⁺可能通过与Tv-CatD催化位点直接结合而阻断酶活性。与人组织蛋白酶D的相互作用残基存在差异，可能源于两者的结构相似性差异（轻链48.5%、重链33.6%相似性）。值得注意的是，此前研究报道Fe²⁺对人组织蛋白酶D的抑制不显著（10%），而本研究发现Fe²⁺在0.25 mM（IR）和0.5 mM（HI）浓度下即显著抑制Tv-CatD活性，表明Tv-CatD对铁的敏感性更高。此外，Zn²⁺的抑制作用开辟了新的研究领域。

研究还发现，不同于TvLEGU-1和TvLEGU-2在60分钟内完全释放，Tv-CatD在60分钟后仍未完全分泌，提示可能存在分泌期间的新蛋白合成或需要更长的分析时间。这些数据揭示了不同蛋白酶之间以及同一蛋白酶在不同环境条件下的分泌机制差异。

综上，铁对Tv-CatD的调控呈现双向性：在转录后水平增加蛋白量，同时在翻译后水平直接抑制其酶活性。这种双重调控的生物学意义需要进一步研究。未来应探讨其他蛋白酶是否也存在类似的蛋白质水平正调控与酶活性直接抑制的联合调控模式。这些发现为理解滴虫病感染期间毒力因子的调控机制提供了新见解。

**结论：** 本研究揭示了铁能在不同水平调控Tv-CatD蛋白的表达和蛋白水解活性。在转录水平上，铁不引起tv-catd mRNA量的差异；但在蛋白质水平上，铁在转录后水平正调控Tv-CatD。在酶活性方面，铁作为Tv-CatD的另一种特异性抑制剂，以浓度依赖性方式降低其酶活性，因此铁也在翻译后水平发挥作用。此外，该蛋白酶可能通过囊泡介导的分泌也受铁正调控。Tv-CatD在分泌产物中具有酶活性，提示其可能在阴道毛滴虫感染期间作为毒力因子发挥作用，可能通过参与溶血和血红蛋白降解实现，如同其他组织蛋白酶D天冬氨酸蛋白酶。