《Brazilian Journal of Microbiology》：Lactic acid bacteria, potentially probiotic, in whole-grain pet biscuits: survival and technological potential of millet-based formulations (Pennisetum glaucum)
编辑推荐：
摘要：人与宠物之间的紧密联系推动了功能性食品的发展。本研究旨在开发含有副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）GV17和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）GV103的宠物饼干，并评估小麦粉、小米粉及两者复配对乳
摘要：人与宠物之间的紧密联系推动了功能性食品的发展。本研究旨在开发含有副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）GV17和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）GV103的宠物饼干，并评估小麦粉、小米粉及两者复配对乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）稳定性、模拟胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）条件耐受性、技术特性及贮藏期间存活性的影响。研究人员采用小麦粉（wheat flour, WF）、小米粉（millet flour, MF）及混合粉（wheat-millet flour, WMF）制备了三种配方，并将GV17、GV103菌株及其混合培养物（GV17.103）接种于饼干凹槽中。面粉类型显著影响配方的理化及技术特性。WF配方具有较高的亮度值（76.31），而WMF配方表现出较高的硬度（46.18 N），表明其具有更强的抗断裂能力。MF配方的脂质（24.80%）和纤维（5.76%）含量较高，WMF配方水分含量较高（12.49%），WF配方碳水化合物含量较高（55.95%）。在模拟消化结束时，所有配方的LAB计数均恢复至7.0 log CFU/mL以上。WF103、MF103和MF17.103在贮藏稳定性方面表现突出。结果表明，所测试的基质适用于开发含有潜在益生LAB菌株的宠物饼干。
**论文解读：基于小米配方的全谷物宠物饼干中潜在益生乳酸菌的存活与技术特性**
**1. 研究背景与问题提出**
随着人口结构变化及家庭规模缩小，宠物饲养率持续上升，推动了营养强化型宠物食品需求的增长。与此同时，犬类中抗生素的不当使用可能促进多重耐药菌的出现，这一问题引发了广泛关注。因此，通过功能性食品干预以维持宠物肠道微生态平衡被视为一种具有前景的疾病预防策略。研究表明，犬的肠道微生物群在基因含量和饮食响应方面与人类高度相似，益生菌 supplementation 可能有助于调节肠道菌群，改善宠物及其主人的生活质量。
乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）作为公认的益生菌来源，其在食品基质中的稳定性与存活能力是产品开发的关键制约因素。LAB的稳定性受温度、湿度、氧气暴露等因素影响，同时与递送基质是否具有益生元特性密切相关。小米（Pennisetum glaucum）作为一种营养丰富、富含膳食纤维、矿物质及酚类化合物的谷物，具有较低的升糖指数，相较于小麦具有更高的营养价值。然而，小米在巴西的利用程度较低，尤其是在动物饲料领域。将小米粉与潜在益生LAB结合应用于犬用饼干配方，有望成为一种递送功能性成分、促进犬类健康的新策略。本研究基于小米配方可能比小麦配方更有效保护LAB在贮藏及模拟胃肠道消化过程中存活性的假说，系统评估了不同面粉基质对LAB存活、理化特性及技术性能的影响。
**2. 研究目的与实验设计概述**
本研究旨在开发含有潜在益生菌株副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）GV17和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）GV103的功能性犬用饼干，并评估小麦粉、小米粉及其复配对面团及成品理化特性、LAB模拟胃肠道耐受性及贮藏期存活性的影响。研究人员采用三种面粉配方——纯小麦粉（wheat flour, WF）、纯小米粉（millet flour, MF）及小麦-小米混合粉（wheat-millet flour, WMF），将两种菌株单独或联合（GV17.103）接种于饼干表面凹槽中，并以糊化玉米淀粉涂层作为保护屏障。所有样品在4°C条件下贮藏28天，定期监测LAB活菌数变化。
**3. 关键技术方法**
本研究所用GV17和GV103菌株分离自巴西米纳斯吉拉斯州Campos das Vertentes地区生产的米纳斯传统奶酪，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）鉴定至菌种水平。饼干制作参考González-Forte等的方法进行改良，面粉过500 μm筛网以确保粒径均一。LAB菌株在MRS肉汤中活化后，经离心浓缩重悬于磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）中，接种于烤后饼干中央凹槽，再以糊化玉米淀粉悬浮液涂覆形成保护层。贮藏试验在4°C无菌包装条件下进行28天。模拟胃肠道试验采用体外序贯消化法，将含菌饼干样品依次暴露于含胃蛋白酶的模拟胃液（pH 2.0，120 min）和含胰酶及胆汁盐的模拟肠液（pH 8.0，360 min），于各时间点测定活菌数。统计学分析采用方差分析（ANOVA）和Tukey检验比较配方间差异，并采用线性回归模型评估时间、菌株及配方对细菌计数的影响。
**4. 研究结果**
**4.1 色泽、质构及近似组分的配方差异**
色泽测定结果显示，WF配方具有最高的L*值（76.31），MF配方L*值最低（43.19），a*和b*值均以MF配方最高，表明小米粉使饼干呈现更深的红黄色调。质构分析表明，WMF配方硬度最高（46.18 N），显著高于WF（26.65 N）和MF（23.17 N）配方，显示混合粉配方具有更强的抗断裂能力。近似组分分析方面，所有配方水分含量均低于14%，有利于延长货架期。MF配方的脂质（24.80%）、纤维（5.65%）和灰分（5.67%）含量最高，WF配方的碳水化合物含量最高（55.95%），WMF配方的水分含量最高（12.49%）。蛋白质含量在三种配方间无显著差异。小米中较高的矿物质和纤维含量被认为是导致相应配方灰分及纤维升高的主要原因。
**4.2 贮藏期间LAB存活率**
在4°C贮藏28天后，各配方的LAB存活情况存在显著差异。含GV103菌株的配方表现出最高的终末活菌数，WF103达7.23 log CFU/g，MF103达7.10 log CFU/g，WMF103达6.24 log CFU/g。含GV17菌株的配方终末计数在4.34至5.32 log CFU/g之间，联合菌群配方介于5.15至5.55 log CFU/g。以存活势（δ）为评价指标（δ≥?0.5 log视为有利于菌株存活），WF103（δ=?0.45 log）、MF103（δ=?0.37 log）和MF17.103（δ=?0.46 log）为最有效维持LAB活力的配方。线性回归模型结果显示，WMF配方与贮藏时间之间存在显著交互作用。
**4.3 模拟胃肠道条件下的LAB存活**
经过模拟胃液和肠液消化后，所有配方的LAB计数在消化终点均维持在7.0 log CFU/mL以上。MF17（10.16 log CFU/mL）、MF103（10.20 log CFU/mL）和WF103（9.30 log CFU/mL）在胃相结束后保持了最高的活菌数。MF17、WMF17、WF103和WMF103配方在整个模拟消化过程中未出现显著的活菌数下降。值得注意的是，MF103（9.10 log CFU/mL）和MF17.103（8.46 log CFU/mL）在肠相结束后仍保持较高的存活水平，表明小米基质为LAB提供了良好的保护环境。
**5. 讨论与结论**
本研究表明，面粉类型显著影响宠物饼干的色泽、硬度及营养组成，这主要归因于小米天然的颜色、较高的矿物质和纤维含量以及缺乏面筋网络等特性。小米配方较低的硬度可能与面筋缺失有关，而其较高的脂质和纤维含量则反映了小米籽粒的固有组成特征。
在LAB存活方面，GV103菌株在小米粉配方中的良好稳定性可能与其淀粉代谢能力有关。部分产淀粉酶的LAB菌株携带amyA基因，能够分泌胞外α-淀粉酶，利用淀粉作为底物产酸，有利于贮藏期间细胞活力的维持。所有配方在模拟胃肠道消化后均保持了高于7.0 log CFU/mL的活菌数，达到了人类益生菌食品的推荐每日摄入量参考水平。肠相中活菌数的回升可能涉及亚致死损伤细胞的修复、VBNC（viable but non-culturable）状态细胞的复苏以及存活菌株的有限增殖等多种机制。小米中丰富的膳食纤维和酚类化合物可为难消化碳水化合物底物，发挥潜在的益生元效应，促进LAB增殖。
综上所述，本研究所开发的小麦粉、小米粉及其复配为基础的犬用功能性饼干具有适宜的色泽、质构和营养组成。WF103、MF103和MF17.103配方在28天冷藏贮藏期间表现出优异的LAB存活稳定性。所有配方在模拟胃肠道条件下均能满足益生菌食品的推荐摄入量要求。该研究证实了小米基质作为潜在益生LAB递送载体的可行性，为宠物功能性食品的开发提供了实验依据，论文发表于《Brazilian Journal of Microbiology》。
