p16INK4a与DNA甲基化时钟（DNA methylation clocks）在化疗治疗的早期乳腺癌女性中的研究

《GeroScience》：p16INK4a and DNA methylation clocks in women treated with chemotherapy for early breast cancer

　　

候选生物衰老标志物包括外周血T细胞中的p16INK4a（p16）表达（细胞衰老标志物）与全血DNA甲基化（DNAm）时钟（表观遗传衰老标志物）。两者均与癌症和化疗等加速衰老的状态相关，但二者关系研究不足。研究人员在早期乳腺癌女性（n=251）与非癌症对照（n=49）中评估上述标志物；检测T细胞p16表达及五种DNAm时钟（Horvath、Hannum、PhenoAge、GrimAge、Dunedin Pace of Aging〔mPoA〕）。基线关联用Pearson相关，组间比较用校正年龄、种族、民族、BMI的线性模型；化疗亚组分析治疗前后变化。结果显示：p16与DNAm时钟在患者与对照中基线相关均弱（r<0.3）；p16与Horvath或mPoA无显著关联；Hannum、GrimAge、PhenoAge在乳腺癌女性中显著更高且校正后仍存在。化疗后3–6个月p16显著升高，而Horvath、PhenoAge、GrimAge、mPoA无显著变化，Hannum年龄小幅升高（p=0.02）。研究人员得出结论：T细胞p16与全血DNAm时钟仅弱相关且对化疗反应不同，提示细胞衰老与表观遗传时钟反映生物衰老的不同方面，对癌症及其治疗反应不同。

论文解读：《GeroScience》刊发的这项研究中，生物衰老（biological aging）研究关注细胞衰老（cellular senescence，细胞因损伤或应激进入稳定增殖停滞的状态）与表观遗传改变等核心机制。p16^INK4a（p16，CDKN2A编码的 cyclin-dependent kinase inhibitor，可作为T细胞衰老标志物）与全血DNA甲基化时钟（DNA methylation clocks，基于特定CpG位点甲基化水平估算生物学年龄的算法）都被认为是人体可测量的衰老生物标志物，且都与癌症、化疗、吸烟、肥胖等加速衰老因素相关。但目前不清楚这两者捕捉的是相似还是不同的生物衰老维度，也不清楚在癌症及其治疗背景下它们如何相互关联。为此，研究人员开展头对头比较，以明确细胞衰老标志物与表观遗传时钟是否提供重叠信息。

为开展研究，研究人员使用两个队列：城市希望（City of Hope，COH）HOPE前瞻性多中心研究提供65岁及以上、I–III期乳腺癌患者与年龄匹配非癌症对照的横向数据；北卡罗来纳大学（University of North Carolina，UNC）两项前瞻性研究提供18岁及以上、I–III期乳腺癌并接受辅助化疗患者的治疗前后配对样本。技术方法上，研究人员从EDTA抗凝血经阴性选择分离T细胞，用实时定量PCR检测p16基因表达；从全血提取基因组DNA，用Illumina EPIC BeadChip检测甲基化，经minfi、EnMix、preprocessNoob等流程归一化后计算Horvath、Hannum、PhenoAge、GrimAge，并用DunedinPoAm38包计算mPoA；部分血浆用Luminex平台测衰老相关分泌表型（SASP，senescence-associated secretory phenotype，衰老细胞释放的炎症与信号蛋白组合）蛋白。统计采用Pearson相关、年龄校正线性回归与配对分析。

研究结果如下。研究参与者：COH横向队列含251例乳腺癌与49例对照，平均72岁；UNC纵向队列含48例配对样本，平均57岁，58%接受多柔比星（doxorubicin）方案。p16与DNAm时钟的横向关联：COH患者中p16与Hannum（r=0.15）、PhenoAge（r=0.20）、GrimAge（r=0.13）弱相关，与Horvath、mPoA不显著；对照中相关稍强但仍有限；UNC术前患者p16与GrimAge（r=0.40）中等相关，与mPoA无关。癌症与非癌症参与者比较：按年龄绘图并回归显示，GrimAge与PhenoAge在癌症组显著更高（p=0.02、0.03），校正种族、民族、BMI后仍显著（p=0.01、0.04）；p16、Hannum、Horvath、mPoA组间线无显著差异。化疗后p16与DNAm时钟的探索性纵向变化：48例中化疗后p16显著升高（p=0.003），Hannum时钟表观遗传年龄小幅升高（p=0.02），Horvath、PhenoAge、GrimAge、mPoA无显著变化；按p16是否超过检测精度升高分层各24例后，p16升高组的DNAm时钟也未随之改变。p16、表观遗传时钟与SASP的探索性分析：在20例多柔比星化疗者中，化疗诱导的p16变化与PARC、TNFRII、ICAM1、TNFα变化正相关；但基线p16与这些SASP无关联，说明化疗驱动了衰老标志物与分泌表型的协同改变。

讨论部分总结：研究人员指出，p16与DNAm时钟横向相关弱，因p16反映特定免疫细胞中的细胞衰老，而DNAm时钟整合全血异质细胞表观信号；DunedinPoAm测的是衰老速率而非累积年龄，因此与p16更不相关。化疗后3–6个月p16上升而多数时钟不变，并不表示时钟对治疗不敏感，而可能因其响应时程更长或反映不同后果；既往生存者研究在24–36个月或数十年后才见时钟加速。现有时钟未必捕捉化疗致衰老的特定表观改变，且全血时钟受白细胞组成变化干扰。p16与SASP的化疗后关联支持细胞衰老程序被治疗激活。研究局限包括事后分析、纵向样本小、队列异质、 compartments不同、随访短及方案混杂。

研究结论部分翻译：本研究中，研究人员在横向与探索性纵向场景中评估了两类广泛使用的生物衰老标志物——T细胞p16表达与全血DNA甲基化时钟。基线时，p16与DNAm时钟在乳腺癌患者和非癌症对照中关联均弱；而部分DNAm时钟（GrimAge与PhenoAge）在癌症参与者中高于对照。在探索性纵向分析中，p16在化疗后短期内（3–6个月）升高，而多数DNAm时钟在同一区间内未变。综上，p16与DNAm时钟提供非重叠信息，可能反映生物衰老及其对癌症与化疗反应的不同方面。