酵母共培养增强羧肽酶生产：生物量热、呼吸测量及深度学习研究

《Frontiers in Chemical Engineering》：Co-cultivation of yeast to enhance carboxypeptidase enzyme production: biocalorimetric, respirometric, and deep learning investigation

　　

由马克斯克斯鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）生产羧肽酶Y（carboxypeptidase Y, CPDY）通常受到乙醇积累的限制，乙醇积累会抑制酶产量。在本研究中，通过将马克斯克斯鲁维酵母与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共培养以清除乙醇，从而增强CPDY生产，解决了这一挑战。CPDY是一种工业上重要的外肽酶（exopeptidase），用于食品加工、制药和生物精炼应用。研究人员利用响应面法（Response Surface Methodology, RSM）在摇瓶发酵和2 L生物量热反应器中优化了关键培养基组分（酵母氮碱、氯化铵、葡萄糖）。共培养表现出明显的劳动分工：马克斯克斯鲁维酵母从葡萄糖生产CPDY和乙醇，而酿酒酵母迅速消耗乙醇，防止其积累。结果，CPDY活性维持更长时间，酶滴度达到单独培养的约两倍。在摇瓶中获得了8 U/mL的最大CPDY活性，在生物量热器中获得16 U/mL，对应的生物量浓度分别为3 g/L和4.5 g/L。实时代谢热流（量热法）和尾气分析揭示了明显的葡萄糖和乙醇利用阶段，证实了共培养的协同代谢。此外，研究人员开发了一个定制的长短期记忆（Long Short-Term Memory, LSTM）神经网络（“CoYeast-LSTM”）来模拟该生物过程。该LSTM准确预测了关键代谢转变和CPDY产量，均方误差（mean squared error, MSE）为0.0060，平均绝对误差（mean absolute error, MAE）为0.071。这种将共培养发酵与先进监测相结合的综合方法实现了高CPDY活性和改进的实时过程控制。这些发现展示了一种通过微生物共培养结合实时生物过程监测和预测建模实现酶生产的新型可持续策略。

**酵母共培养增强羧肽酶生产的生物量热、呼吸测量及深度学习研究——论文解读**

**一、研究背景与问题**

酵母菌，特别是马克斯克斯鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），是工业上重要的微生物，具有耐受高达45°C温度、利用多种碳源以及公认安全（Generally Regarded As Safe, GRAS）地位等特性。这些酵母产生多种工业上重要的酶，包括羧肽酶Y（carboxypeptidase Y, CPDY），它是一种从肽的羧基末端切割氨基酸的丝氨酸羧肽酶。CPDY在食品强化、风味增强和蛋白质水解物脱苦等方面具有多样化应用，近年研究还表明其在生物质转化中具有潜力，可通过水解木质纤维素结合的蛋白质将农业残留物转化为有价值的氨基酸，并提高下游生物乙醇和聚羟基链烷酸酯（polyhydroxyalkanoates, PHAs）的发酵产量。然而，CPDY生产的一个主要限制是乙醇抑制。K. marxianus在标准条件下表现出优于S. cerevisiae的CPDY生产能力，但其低乙醇耐受性限制了更广泛的工业应用；相反，S. cerevisiae具有较高的乙醇耐受性但产生较低的CPDY活性。混合起始培养物被视为一种经济有效的策略，可在缓解抑制性副产物的同时提高酶产量。共培养利用生物间的互养共生和代谢交叉喂养，实现增强酶生产和提高发酵效率等复杂代谢输出。因此，该研究首次采用生物量热-呼吸测量法考察K. marxianus与S. cerevisiae共培养通过清除乙醇增强CPDY生产，并结合RSM优化、实时生物量热-呼吸监测和人工智能驱动的双向LSTM模型（CoYeast-LSTM），旨在建立控制工程微生物联合体中酶生物合成的系统性框架。该论文发表于《Frontiers in Chemical Engineering》。

**二、主要关键技术方法**

研究人员使用了以下主要技术方法：（1）生物量热法，利用2 L BioRC1e生物量热反应器实时监测代谢热释放；（2）呼吸测量分析，通过气体分析仪测定二氧化碳释放速率（CER）并采用质量平衡方法计算；（3）响应面法（RSM）结合中心复合设计（central composite design, CCD），利用Design Expert?软件对培养基组分进行统计优化；（4）扫描电子显微镜（SEM）进行菌株形态学表征；（5）选择性平板计数法，用YPD琼脂45°C培养和赖氨酸琼脂30°C培养分别选择性验证K. marxianus与S. cerevisiae的共栖维持；（6）构建双向长短期记忆（LSTM）神经网络模型CoYeast-LSTM，融合生物量热和呼吸测量时间序列数据进行过程预测。菌株来源为印度微生物典型培养物保藏中心（MTCC），K. marxianus MTCC 4139和S. cerevisiae MTCC 170。

**三、研究结果**

*3.1 响应面法*

研究人员利用中心复合设计技术获得二阶二次模型方程，用于关联控制变量与响应之间的关系。结果表明，葡萄糖（dextrose）作为两种酵母的共同碳源，对CPDY生产影响最强；酵母氮碱影响次之；氯化铵影响不显著。RSM分析显示CPDY活性随葡萄糖和酵母氮碱浓度升高而下降，在7 g/L酵母氮碱和15 g/L葡萄糖处达到最大CPDY活性6.15 U/mL。规范分析（canonical analysis）定位到更高的预测最大值7.15 U/mL，对应最佳条件为7 g/L酵母氮碱、3.8 g/L氯化铵和15 g/L补充葡萄糖。模型F值分别为79.83（DCW）和68.42（CPDY），R2>0.98，调整R2>0.96，变异系数低于7%，表明模型具有稳健的预测能力，适用于生物反应器放大。

*3.2 摇瓶发酵研究*

在优化的培养基中，混合酵母系统适应良好且滞后期最短。葡萄糖在12小时内被完全消耗，酵母生长在消耗葡萄糖时最初较高，DCW在葡萄糖耗尽时达到3 g/L，随后因乙醇消耗而继续增长。CPDY活性随葡萄糖耗尽而增加，并在乙醇消耗开始时下降，最大CPDY活性8 U/mL在12小时观察到。

*3.3 生物量热和呼吸测量研究*

在2 L BioRC1e装置中，代谢热速率曲线显示发酵无滞后期启动。热速率在9小时达到第一个峰值2.2 W（对应葡萄糖消耗），随后降至14小时的1.45 W，再于17小时达到第二个峰值1.6 W（对应乙醇消耗），31小时进入衰亡期。溶解氧（DO）曲线为热速率曲线的倒数，初始30 ppm，9小时降至零，乙醇消耗期间出现第二个峰。浊度在9小时达500 NTU，静态期结束时增至560 NTU。过程分为三个阶段：阶段I（0–9小时）为葡萄糖消耗；阶段II（9–14小时）为转向期，残留葡萄糖和新生乙醇共消耗；阶段III（14–31小时）为纯乙醇呼吸期，第二个量热峰在17小时达到最大。乙醇浓度在6小时达到20.88 g/L后逐渐下降至32小时3 g/L。热量产量Y_Q/X在三阶段分别为12.63 kJ/g、65.27 kJ/g和15.99 kJ/g。CER出现8小时和18小时双峰。热量呼吸比（calorespirometric ratio, CR）在12小时为410 kJ C-mol^?1 CO₂，确认有氧发酵代谢，随后乙醇呼吸阶段CR值高于1000 kJ C-mol^?1。

*3.4 CoYeast-LSTM预测性能*

CoYeast-LSTM模型快速收敛，训练MSE在第一轮后降至0.01以下，最终训练/验证值分别为0.0043/0.0060（MSE）和0.015/0.018（MAE），泛化差距小于20%。热信号的单变量直方图显示双峰分布，模式位于Q/Q_max≈0.02和0.98，精确对应葡萄糖氧化和乙醇呼吸两个代谢阶段，谷值（0.35–0.65）对应转向窗口，证实量热法可单独作为单传感器阶段判别器。残差分析显示紧密带（IQR≈0.04），80%绝对误差≤0.05，95%≤0.10（归一化），且无极端异常值。在独立测量点上的归一化MSE为0.021，MAE为0.112。

*3.5 生物量和酶产量预测*

DCW的奇偶图显示全发酵轨迹上测量值与预测值高度一致，Deming回归斜率为0.97±0.02，截距0.01，RMSE为0.024（归一化），低于±0.05阈值，可用于替代约30分钟滞后的离线重量法采样。CPDY奇偶图显示模型覆盖完整归一化活性范围0–0.33，Deming回归斜率0.98±0.03，截距0.004，92%的点落在±0.05包络内，在2 L反应器中转化为批终点检测不确定性小于2%。

*3.6 统计性能指标*

CoYeast-LSTM在归一化尺度上获得MSE 0.0060和MAE 0.071，优于ARIMA（MSE=0.031）、前馈神经网络（FNN，MSE=0.019）和标准单向LSTM（MSE=0.012），相比ARIMA改进达80.6%。注意力权重分析显示，网络在乙醇呼吸期（阶段III）对代谢热流（Q）和热量呼吸比（CR）分配最高显著性，与生物量热指纹特征一致。

*3.7 CoYeast-LSTM设计原理*

共培养过程的代谢热速率呈双相模式，分别在9小时和17小时出现峰值，对应葡萄糖和乙醇消耗。LSTM网络的独特记忆单元架构可有效捕捉这种不平滑动态特征和长期时间依赖性。共培养过程表现出跨不同时间尺度的动态变化，从DO的快速变化到生物量积累的较慢变化，而LSTM的门控机制可选择性地记忆或遗忘信息，适合处理多尺度时间模式。代谢热、DO、底物利用和酶生产之间的复杂相互作用高度非线性，LSTM可通过激活函数和循环结构捕捉这些非线性关系。31小时的完整发酵周期存在关键阶段转变，LSTM的专门架构通过门控机制克服了传统循环神经网络（RNN）的梯度消失或爆炸问题。

**四、讨论与结论**

该研究通过K. marxianus与S. cerevisiae的共培养实现了CPDY生产的转化性提升，在生物量热器中达到16 U/mL的CPDY活性，较K. marxianus单培养（12 U/mL）提高33%，较S. cerevisiae单培养（8 U/mL）提高100%，证明了分工联合体设计的协同优势。响应面法确定了支持这些提升产量的优化培养基组成（7 g/L酵母氮碱、3.8 g/L氯化铵和15 g/L补充葡萄糖）。实时量热指纹分析揭示了双相代谢转变，热通量和热量呼吸比可作为过程控制的精确阶段标记。先进的双向CoYeast-LSTM模型实现了高预测精度，利用聚焦于关键阶段代谢热流和比值的注意力机制，实现了准确的CPDY预测，显著增强了实时过程监测和收获精度。经济上，该方法减少了离线采样和运营成本，具有扩展到更大规模的潜力。机理认知、生物量热监测和深度学习的整合建立了一种新的可扩展范式，解决了酶成本和过程可持续性挑战，为符合工业4.0的下一代生物制造铺平了道路。未来方向包括多组学整合、补料分批策略和多菌株共培养以实现进一步改进。研究结论明确表明，共培养策略结合先进的实时监测和预测建模为酶生产提供了一条新颖且可持续的技术路径。