《Animal Research and One Health》：MiniSdd7-Derived Cytosine Base Editor Promotes Efficient Multiplex Gene Knockout in Porcine Primary Fibroblasts
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高效多重基因组编辑对于改善由多个基因控制的牲畜复杂性状至关重要。然而，对于胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editors, CBEs）而言，在多个位点实现高效率的同时编辑仍具有挑战性，这主要是由于编辑效率的变异性和脱氨酶活性的局限性。在本研究中，
高效多重基因组编辑对于改善由多个基因控制的牲畜复杂性状至关重要。然而，对于胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editors, CBEs）而言，在多个位点实现高效率的同时编辑仍具有挑战性，这主要是由于编辑效率的变异性和脱氨酶活性的局限性。在本研究中，研究人员开发并优化了一个多重碱基编辑框架，针对猪的三个经济重要性基因——APN、CD163和MSTN。通过将高保真YE1-BE4max-SpG系统与工程化sgRNA支架相结合，研究人员首先建立了一个能够同时进行多基因修饰的基线编辑平台。尽管编辑成功，三基因纯合突变的效率仍然有限。为了克服这一瓶颈，研究人员将工程化miniSdd7脱氨酶整合到BE4max-SpG架构中，并评估了其在猪多重基因组编辑中的性能。由此产生的miniSdd7-BE4max-SpG系统显著提高了所有三个位点的编辑效率。值得注意的是，三基因编辑克隆的比例从11.11%增加到38.10%，与基于YE1的CBE系统相比提高了三倍以上。重要的是，在预测的候选位点未观察到可检测的脱靶突变，表明该系统在所检查区域内保持高特异性。总之，本研究在猪细胞中建立了一种有效的多重碱基编辑策略，并证明脱氨酶工程是编辑性能的关键决定因素。miniSdd7-BE4max-SpG系统为精确的多基因修饰提供了强大工具，并具有加速牲畜遗传改良的巨大潜力。
该论文发表于《Animal Research and One Health》。传统猪育种策略针对快速生长、肉质优良、抗病力强等性状往往耗时且成本高昂，且猪的大多数经济性状均由多基因控制。基于CRISPR/Cas9的常规编辑依赖双链断裂（DSB），经由非同源末端连接（NHEJ）修复，常导致难以预测的插入或缺失。相比之下，碱基编辑技术通过将脱氨酶与Cas蛋白融合，无需产生DSB即可实现精确的单核苷酸替换，其中胞嘧啶碱基编辑器（CBE）可介导C-to-T转换，在编码序列内引入提前终止密码子从而实现功能基因敲除。然而，CBE在复杂多位点编辑场景中仍面临两大挑战：一是可造成不依赖sgRNA的脱靶编辑，二是高保真变体虽能降低脱靶，却往往导致靶位点编辑效率下降。因此，在维持高保真度的同时提高多重编辑效率是亟待解决的关键问题。研究人员旨在通过整合Cas9变体优化、sgRNA支架工程以及脱氨酶替换等策略，在猪细胞中建立高效、可靠的多重碱基编辑平台。
研究人员选用猪胎儿成纤维细胞（PFFs）为实验模型，设计了靶向APN、CD163和MSTN三个基因的sgRNA。方法上，研究人员构建了YE1-BE4max-SpG和miniSdd7-BE4max-SpG等碱基编辑器质粒，并通过电穿孔共转染至PFFs；利用荧光激活细胞分选（FACS）获得单细胞来源的单克隆细胞系；通过Sanger测序结合EditR分析编辑效率；使用Cas-OFFinder和CRISPOR工具预测潜在脱靶位点，并选取每个sgRNA排名前五的位点进行Sanger测序验证。
结果部分如下：
2.1 筛选高保真CBE系统并优化APN/CD163/MSTN靶位点：研究人员在APN、CD163和MSTN编码区内设计多个sgRNA，比较了YE1-BE4max、YEE-BE4max及其SpG PAM扩展变体的编辑活性。结果显示，YE1-BE4max-SpG在非NGG PAM位点（如MSTN-g4的AGA PAM）表现出更高的编辑活性，在APN-g15-C7、CD163-g6-C5和MSTN-g4-C4位点分别达到16%、20%和15%的效率。
2.2 HECG-Lock sgRNA支架结构优化增强碱基编辑效率：在YE1-BE4max-SpG基础上，研究人员采用HECG和HECGL两种sgRNA支架工程策略。HECGL-sgRNA在三个靶位点的编辑效率分别提升至约25%、35%和45%，平均提高1.84倍，显著优于常规sgRNA和HECG-sgRNA。
2.3 使用YE1-BE4max-SpG在猪细胞中同时突变APN/CD163/MSTN：经单细胞分选获得36个单克隆并分型，APN、CD163和MSTN的单基因编辑效率分别为19.44%、41.67%和55.56%；其中16.67%克隆为单基因编辑，33.33%为双基因编辑，11.11%实现三基因同时编辑。获得一个三基因纯合突变克隆3BE-25，在三个位点均引入提前终止密码子（APN-W616Stop、CD163-W488Stop和MSTN-Q93Stop）。
2.4 MiniSdd7-BE4max-SpG显著增强多重基因组编辑效率：将miniSdd7脱氨酶替代rA1-YE1后，三个靶位点的平均编辑效率提高至77.0%、87.3%和95.7%，整体提高约2.76倍。三基因同时编辑的克隆比例从11.11%升至38.10%，提高超过三倍，并成功获得多个三基因纯合突变细胞系。
2.5 碱基编辑器BE4max-SpG融合rA1-YE1或miniSdd7在预测高风险位点无明显脱靶活性：通过Cas-OFFinder和CRISPOR预测并选取15个潜在高危位点进行Sanger测序，两种编辑器均未检测到显著脱靶编辑，表明系统在所检测区域内具有高特异性。
讨论部分指出，多重基因编辑效率不仅受sgRNA支架影响，脱氨酶本身的催化活性和编辑窗口特性更是决定性因素。miniSdd7具有更宽的编辑窗口和更高的C-to-T转换效率，虽然有效提升了多重编辑效率，但也增加了旁观者编辑频率，体现了效率与特异性之间的权衡。此外，研究仅分析了预测位点的Cas9依赖性脱靶，尚需全基因组测序或GUIDE-seq等进行全面的安全性评估。研究结论为：研究人员建立了一种高效且可扩展的多重胞嘧啶碱基编辑平台，并证明脱氨酶优化是决定多重编辑效率的关键因素；miniSdd7-BE4max-SpG系统为猪的精确多基因修饰提供了强有力工具，对功能基因组学和农业生物技术具有重要应用价值。
