《Genome》：Genome-wide analysis of lipoxygenase genes in Coffea arabica and its diploid progenitors
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脂氧合酶蛋白（LOXs）在植物生长、发育和防御中发挥关键作用，尤其通过参与茉莉酸（JA）生物合成。本研究旨在鉴定并表征三个咖啡物种——小粒咖啡（Coffea arabica）、中粒咖啡（Coffea canephora）和狭叶咖啡（Coffea eugenio
脂氧合酶蛋白（LOXs）在植物生长、发育和防御中发挥关键作用，尤其通过参与茉莉酸（JA）生物合成。本研究旨在鉴定并表征三个咖啡物种——小粒咖啡（Coffea arabica）、中粒咖啡（Coffea canephora）和狭叶咖啡（Coffea eugenioides）中编码LOX的基因，并评估在己酸处理后小粒咖啡中LOX基因是否存在差异表达。研究人员在小粒咖啡中鉴定出18个LOX基因，在狭叶咖啡和中粒咖啡中各鉴定出9个基因。染色体定位分析显示，四倍体小粒咖啡的LOX基因与其推定二倍体祖先狭叶咖啡和中粒咖啡的LOX基因之间存在强烈的对应关系。转录组学和酶学分析表明，己酸处理可调节小粒咖啡品种Catuaí Vermelho和Obat?叶片和根系中特定LOX基因的表达并改变LOX活性。值得注意的是，三个LOX基因的转录本丰度与酶活性之间表现出强相关性。综上所述，这些结果表明小粒咖啡中一部分LOX基因是进行详细功能分析的有前景的候选基因，因为它们可能对咖啡属物种中LOX活性和诱导子诱导的防御反应具有重要贡献。
**咖啡及其二倍体祖先脂氧合酶基因家族的全基因组解析与己酸应答特征**
**研究背景与科学问题**
脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）是一类含有非血红素铁或锰辅基的氧化还原酶，广泛存在于原核和真核生物中，在植物体内参与生长、发育、衰老、种子萌发以及生物和非生物胁迫响应等多种生物学过程。LOX催化分子氧掺入多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs），主要作用于亚油酸（18:2）和α-亚麻酸（18:3），在C-9或C-13位产生氢过氧化物，进而生成包括茉莉酸（jasmonic acid, JA）在内的多种生物活性oxylipin类物质。JA作为重要的信号分子，在植物防御反应中发挥核心作用。此前研究表明，外源施用己酸（hexanoic acid, HX）可诱导咖啡幼苗对细菌性叶斑病和叶锈病的抗性，且该防御反应部分依赖于LOX和JA相关信号通路。然而，尽管LOX在胁迫信号中具有核心地位，咖啡中LOX基因和蛋白质的系统知识仍较为匮乏，相关研究仅限于少数生理学实验，如叶潜蝇为害后叶片LOX活性的变化等。鉴于LOX对植物生长和抗逆的重要性，以及此前仅在中粒咖啡中开展了LOX基因鉴定，全面开展咖啡属物种LOX基因家族的全基因组分析，对于阐明其功能多样性和生物学潜力十分必要。
**研究内容与主要结论**
本研究对三个咖啡物种——四倍体小粒咖啡及其二倍体祖先中粒咖啡和狭叶咖啡——进行了LOX基因家族的全基因组鉴定、基因组学与系统发育表征，并利用两个遗传背景不同的巴西主栽品种Catuaí Vermelho IAC 144和Obat? IAC 1669-20，结合RNA-seq、RT-qPCR及酶活测定，解析了己酸处理下小粒咖啡LOX基因的转录响应和酶活性变化。研究共鉴定出小粒咖啡18个LOX基因，狭叶咖啡和中粒咖啡各9个LOX基因，其中小粒咖啡的LOX基因数目与其异源四倍体起源所预期的近加性模式一致。染色体定位分析显示，小粒咖啡两个亚基因组上的LOX基因与相应二倍体祖先之间存在高度共线性，但在Ca4e/Ce4和Ca11e/Ce11染色体上存在局部拷贝数差异。系统发育分析将所有LOX蛋白划分为LOX9和LOX13两大经典类群。转录组分析揭示了CaLOX基因在器官和果实发育阶段呈现显著差异表达，多数基因在营养组织中高表达，尤其以根部表达最为突出。己酸处理显著调节了多个CaLOX基因的转录水平，并改变了叶片和根系中的LOX酶活性，且不同品种间响应模式存在明显差异。相关性分析鉴定出CaLOX2、CaLOX8和CaLOX15与LOX酶活性呈强正相关，CaLOX13和CaLOX16呈中等相关，提示这些基因可能是小粒咖啡LOX酶活性的主要贡献者。该研究发表于《Genome》期刊。
**主要关键技术方法**
研究人员以实验室前期注释的中粒咖啡LOX基因序列为查询序列，利用BLAST工具对小粒咖啡（NCBI登录号GCA_003713225.1）和狭叶咖啡（NCBI登录号GCA_003713205.1）基因组进行相似性搜索，筛选高置信度候选基因。随后使用MapGene2Chromosome v2绘制染色体定位图，利用Gene Structure Display Server v2.0分析基因外显子-内含子结构。系统发育分析采用MUSCLE比对和最大似然法构建进化树。亚细胞定位预测整合了Plant-mSubP、DeepLoc 2.0和Euk-mPLoc 2.0三种工具。转录组数据来自前期己酸处理实验（ENA登录号PRJEB39901和PRJEB52366）和果实发育阶段文库（PRJEB24137），经fastp质控后用CLC Genomics Workbench进行定量和差异表达分析。RT-qPCR验证使用GAPDH和EF1作为内参基因，LOX酶活测定以亚油酸为底物监测234 nm吸光度变化，并用Spearman秩相关分析基因表达与酶活的关系。样本来源于5个月龄的Catuaí Vermelho IAC 144和Obat? IAC 1669-20幼苗，水培条件下进行己酸（0.55 mM）处理48小时。
**研究结果**
**LOX基因鉴定与理化性质分析：** 通过BLAST搜索，研究人员在小粒咖啡中鉴定出18个LOX基因（CaLOX1–CaLOX18.2），在狭叶咖啡中鉴定出9个（CeLOX1–CeLOX9），结合前期报道的中粒咖啡9个LOX基因（CcLOX1–CcLOX9），三个物种共36个LOX基因。这些基因的CDS长度介于2091–2820 bp，编码蛋白长度为693–939个氨基酸，分子量范围为76.78–106.53 kDa。
**染色体定位与共线性分析：** 染色体图谱显示，小粒咖啡两个亚基因组上的LOX基因与其二倍体祖先存在高度对应关系。中粒咖啡来源亚基因组上的LOX基因与中粒咖啡染色体位置完全一致；狭叶咖啡来源亚基因组大体保守，但在Ca4e染色体上存在3个LOX基因而Ce4上仅1个，Ca11e上仅1个而Ce11上有2个，表明存在局部拷贝数变异。
**基因结构与亚细胞定位：** 三个物种的LOX基因具有高度保守的外显子-内含子结构，小粒咖啡含8–9个外显子，狭叶咖啡含7–11个外显子，中粒咖啡含8–9个外显子。部分基因含有约3–6.5 kb的超长内含子，暗示其转录后加工可能更为复杂。亚细胞定位预测显示，所有LOX9蛋白均定位于细胞质，所有LOX13蛋白均定位于质体，仅CcLOX4例外。
**系统发育分析：** 基于最大似然法构建的系统发育树将所有LOX蛋白划分为LOX9和LOX13两大经典类群，大多数分支具有高自展支持率（>90%）。咖啡LOX蛋白与拟南芥、胡萝卜等真双子叶植物的LOX序列聚类，符合植物LOX基因家族的经典进化分类。
**RNA-seq转录谱：** 在叶片、根系和三个果实发育阶段（绿、黄、红果）中，19个CaLOX转录本（含CaLOX18.1和CaLOX18.2两个剪接变体）均至少在一个条件下检测到表达。经TPM>5过滤后，14个CaLOX基因用于后续比较。其中8个基因（CaLOX1、CaLOX2、CaLOX3、CaLOX4、CaLOX7、CaLOX8、CaLOX14、CaLOX18.2）在根部表达最高，5个（CaLOX5、CaLOX11、CaLOX12、CaLOX13、CaLOX15）在叶部最高，仅CaLOX6在果实中最高。果实发育阶段整体表现为绿果高、黄果中、红果低的趋势。不同品种间也存在明显差异，Catuaí Vermelho在根部和叶部均表现出更大的表达异质性。
**己酸响应的转录调控：** 在19个CaLOX基因中，16个至少在一种器官或品种中表现出显著的转录调控。根部比叶片表现出更广泛的响应。CaLOX4是唯一在两种器官和两个品种中均被调控的基因，在Catuaí Vermelho根部下调而在Obat?根部和两个品种的叶片中上调。品种特异性响应明显：Catuaí Vermelho根部有13个基因被调控，Obat?根部有12个基因被调控；叶片中CaLOX11和CaLOX12仅在Catuaí Vermelho中下调。
**RT-qPCR验证：** 对12个经RNA-seq鉴定为受己酸调控的基因进行RT-qPCR验证，结果表明这些基因在对照条件下的器官表达模式和在己酸处理后的调控方向大部分与转录组预测趋势一致，但部分基因存在定量差异，反映了RNA-seq与RT-qPCR在技术灵敏度和生物学重复上的固有差异。
**LOX酶活与相关性分析：** 己酸处理显著提高了Catuaí Vermelho叶片和根系以及Obat?根系的LOX酶活性，Obat?叶片中未检测到显著增加。Spearman相关性分析显示，CaLOX2、CaLOX8和CaLOX15的表达与酶活呈强正相关（r=0.8），CaLOX13和CaLOX16呈中等正相关（r=0.6），这些基因可能构成小粒咖啡LOX活性的主要来源。
**讨论与结论**
讨论部分指出，小粒咖啡中LOX基因数目（18个）与其异源四倍体起源所预期的近加性效应相符。CaLOX18.1和CaLOX18.2来自同一基因座的剪接变体，暗示可变剪接可能为咖啡提供额外的LOX功能调控层。染色体共线性的高度保守性与棉花等异源四倍体物种中观察到的LOX基因家族演化模式一致。与小粒咖啡果实成熟期LOX表达不突出相反，多数CaLOX基因在营养器官尤其根部高表达，这一特征在双子叶植物中较为少见，提示咖啡中LOX功能可能更偏向于营养生长和根部介导的胁迫响应。己酸诱导的转录与酶活变化在不同品种间呈现明显差异，这与品种间固有的遗传背景差异有关。综合来看，CaLOX2、CaLOX8和CaLOX15等候选基因值得进一步进行功能验证。研究结论认为，该工作提供了咖啡LOX基因家族的全基因组视图，揭示了其在异源四倍体中的保守性与分化特征，并为后续利用LOX基因改良小粒咖啡抗逆性奠定了重要基础。
