《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Palmitoylation-related lncRNAs link molecular signaling, immune remodeling, and tumor progression in glioma: prognostic modeling and functional validation of LYRM4-AS1
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摘要
背景：胶质瘤是一种分子异质性中枢神经系统肿瘤，具有多变的临床行为、免疫格局和治疗反应。棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，可调节膜定位、突触信号、炎症通路和致癌信号；然而，棕榈酰化相关长链非编码RNA（palmitoylation-related long
摘要
背景：胶质瘤是一种分子异质性中枢神经系统肿瘤，具有多变的临床行为、免疫格局和治疗反应。棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，可调节膜定位、突触信号、炎症通路和致癌信号；然而，棕榈酰化相关长链非编码RNA（palmitoylation-related long non-coding RNAs, PRlncRNAs）在胶质瘤中的预后及功能意义尚未完全明确。
方法：研究人员从TCGA数据库中获取429例胶质瘤患者的转录组及临床数据。利用30个棕榈酰化相关基因（palmitoylation-related genes, PRGs）通过共表达分析鉴定PRlncRNAs。采用单因素Cox回归、LASSO-Cox回归和多因素Cox回归构建预后特征。通过Kaplan-Meier分析、ROC曲线、时间依赖性ROC分析、Cox回归、C-index分析、列线图建模、校准曲线以及包含46对胶质瘤及癌旁组织的机构临床队列对该模型进行评价。进行了功能富集分析、免疫反卷积、肿瘤微环境评分、基于TIDE的免疫治疗预测、TMB/MSI分析及基于pRRophetic的药物敏感性分析。采用U87和U251胶质瘤细胞、LYRM4-AS1敲低、体外功能实验及裸鼠异种移植模型进行生物学验证。
结果：由POLR2J4、LYRM4-AS1、BX640514.2、AL592295.6、AL390755.1和AC018730.1组成的六-PRlncRNA特征将胶质瘤患者分为总生存期显著不同的高风险组和低风险组。风险评分仍为独立预后因素，并对1年、3年和5年生存率表现出较强的预测性能。风险相关基因富集于细胞外基质组织、白细胞介导免疫、神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号、细胞因子-受体相互作用、细胞周期程序及ECM-受体相互作用。高风险肿瘤表现出较高的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分，多种免疫检查点基因表达升高，TIDE评分升高，TMB/MSI水平升高。临床验证证实了六种PRlncRNAs的差异表达及风险评分的预后价值。在功能上，LYRM4-AS1敲低抑制胶质瘤细胞增殖、EdU掺入、迁移、侵袭和集落形成，同时抑制异种移植瘤生长，增加TUNEL阳性凋亡细胞，并降低Ki-67、CD31和MMP9表达。
结论：本研究鉴定了一个棕榈酰化相关lncRNA特征，该特征整合了胶质瘤中的分子信号、免疫重塑和预后。LYRM4-AS1作为胶质瘤进展的功能驱动因子，可能代表神经肿瘤发生与免疫微环境调控交叉处的候选生物标志物和治疗靶点。
胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，具有显著的分子、组织学和临床异质性。当前分类整合了组织病理学与分子特征，包括IDH突变、1p/19q共缺失和MGMT启动子甲基化。尽管采取最大安全切除、放疗、替莫唑胺化疗及新兴分子指导策略，侵袭性胶质瘤患者长期生存仍不佳且易复发。大规模转录组研究显示胶质瘤由不同分子状态和细胞生态系统组成，单细胞分析进一步揭示胶质瘤细胞动态占据神经祖细胞样、少突胶质祖细胞样、星形细胞样和间充质样状态。胶质瘤进展还受到脑肿瘤微环境尤其是小胶质细胞/巨噬细胞和淋巴细胞的影响。
蛋白棕榈酰化是一种可逆的翻译后脂质修饰，将脂肪酰链连接至蛋白质，调节膜结合、运输、稳定性和信号活性。棕榈酰化由DHHC家族棕榈酰转移酶介导，并被去棕榈酰化酶逆转，从而动态控制蛋白质定位和功能。在神经系统中，棕榈酰化控制突触定位、受体运输、神经元兴奋性和活动依赖性可塑性，因此失调的棕榈酰化可同时影响神经功能和恶性转化。泛癌棕榈酰化谱分析提示棕榈酰化相关基因参与肿瘤发生和免疫调节。然而，胶质瘤中与棕榈酰化相关的非编码RNA层面仍缺乏系统表征。
长链非编码RNA通过染色质重塑和转录调控参与基因表达，还参与RNA稳定性、竞争性内源RNA网络及与RNA结合蛋白的相互作用。在肿瘤中，lncRNA促成增殖、侵袭、干性、免疫逃逸和治疗抵抗，其组织特异性表达和调控多样性使其成为肿瘤生物标志物发现的候选分子。鉴于lncRNA可整合分子信号状态与肿瘤细胞行为及微环境反应，棕榈酰化相关lncRNA可能为胶质瘤风险分层和机制发现提供生物学上有意义的策略。
研究人员利用TCGA-Glioma数据集获取429例胶质瘤患者的转录组和临床信息，并从既有棕榈酰化研究中筛选30个PRGs。通过PRGs与lncRNAs的Pearson相关分析鉴定PRlncRNAs（|相关系数|>0.4且P<0.001），单因素Cox回归筛选预后相关PRlncRNAs（P<0.05），LASSO回归通过10折交叉验证减少过拟合，多因素Cox回归构建最终预后模型。风险评分=各PRlncRNA系数与其表达水平的乘积之和。根据中位风险评分将患者分为高风险和低风险组。随后在总队列、训练队列、验证队列及包含46对配对胶质瘤和癌旁组织的临床队列中进行预后验证。功能富集分析使用limma、clusterProfiler和GSEA。免疫浸润和肿瘤微环境分析使用CIBERSORT、ssGSEA、xCell、quanTIseq、TIMER、EPIC、MCP-counter和ESTIMATE。免疫治疗反应采用TIDE算法、IMvigor210数据集及自收集抗PD-1/PD-L1治疗队列进行预测。TMB/MSI和药物敏感性分别比较和预测。功能验证在U87和U251胶质瘤细胞中进行：通过shRNA敲低LYRM4-AS1，开展CCK-8增殖、EdU掺入、划痕愈合、Transwell迁移/侵袭、集落形成实验，并在裸鼠皮下异种移植模型中评价肿瘤生长、TUNEL凋亡和Ki-67、CD31、MMP9免疫组化。
研究结果分述如下：
（1）预后相关PRlncRNAs的鉴定与风险特征构建：共鉴定604个PRlncRNAs，单因素Cox回归筛出104个生存相关PRlncRNAs，LASSO-Cox回归和多因素Cox回归最终确定六-PRlncRNA特征：POLR2J4、LYRM4-AS1、BX640514.2、AL592295.6、AL390755.1和AC018730.1。风险评分公式为：风险评分=POLR2J4×0.459+LYRM4-AS1×0.535+BX640514.2×0.259+AL592295.6×(-0.627)+AL390755.1×0.126+AC018730.1×(-0.468)。
（2）预后验证：在总队列、训练队列和验证队列中，高风险组均表现出显著更差的总生存期，风险评分分布图、生存状态图、表达热图和Kaplan-Meier曲线一致支持模型的稳健分层能力。
（3）风险评分与临床病理特征的关系：年龄、肿瘤分级、IDH状态、1p/19q共缺失状态和MGMT启动子甲基化状态在高低风险组间显著不同，而性别无显著差异。亚组生存分析显示高风险患者在临床相关分层中均预后更差。
（4）独立预后价值与列线图：单因素Cox回归显示年龄、分级、IDH状态、1p/19q状态、MGMT状态和风险评分均与生存显著相关；多因素Cox回归确认年龄、分级、1p/19q共缺失状态和风险评分为独立预后因素。时间依赖性ROC的1、3、5年AUC分别为0.886、0.935和0.894。列线图和校准曲线显示预测与观察良好吻合。
（5）功能富集分析：共1088个DEGs富集于细胞外基质组织、白细胞介导免疫、含胶原细胞外基质、突触膜、抗原结合及细胞外基质结构成分等GO条目；KEGG富集到神经活性配体-受体相互作用、人乳头瘤病毒感染、MAPK信号等通路。GSEA显示高风险组富集细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用、ECM-受体相互作用和造血细胞谱系，低风险组富集氧化磷酸化和心肌收缩相关基因集。
（6）免疫浸润与肿瘤微环境：CIBERSORT显示高风险组T细胞亚群、巨噬细胞相关群体、中性粒细胞等浸润增加，低风险组活化NK细胞和单核细胞相对较高。ssGSEA、xCell、quanTIseq、TIMER、EPIC和MCP-counter进一步支持该关联。高风险组StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore显著更高，且风险评分与这些评分正相关。
（7）免疫治疗反应、TMB和MSI：高风险组中CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、SIGLEC15、ITPRIPL1和IGSF8显著上调，TIGIT无显著差异。TIDE分析显示低风险组预测免疫治疗应答者比例更高，高风险组TIDE评分、功能障碍评分和排斥评分更高。IMvigor210队列中模型AUC为0.622；自收集抗PD-1/PD-L1队列中非应答者风险评分显著更高，AUC为0.753。高风险组TMB和MSI更高，高TMB+高风险及高MSI+高风险患者预后最差。
（8）药物敏感性预测：高风险组对5-氟尿嘧啶、顺铂、吉西他滨、伊立替康、曲美替尼、塔拉佐帕尼等多种药物预测IC50更低。
（9）临床和细胞验证：46对临床样本中POLR2J4、LYRM4-AS1、BX640514.2和AL390755.1在胶质瘤组织中显著上调，AL592295.6和AC018730.1显著下调。临床队列中高风险患者生存更差（P=0.020，HR=2.57），1、3、5年AUC分别为0.891、0.881和0.880。六种lncRNA在胶质瘤细胞系与正常星形胶质细胞中差异表达。
（10）LYRM4-AS1敲低抑制恶性表型：shRNA敲低LYRM4-AS1显著降低U87和U251细胞活力、EdU阳性率、迁移和侵袭能力以及集落形成。
（11）体内功能验证：裸鼠异种移植中，LYRM4-AS1敲低组肿瘤体积和重量显著减小，TUNEL阳性凋亡细胞增加，Ki-67、CD31和MMP9表达降低。
讨论部分指出，该六-PRlncRNA特征在TCGA队列和独立临床队列中均稳定分层预后，且独立于已知临床分子变量。高风险的免疫富集表型并非抗肿瘤免疫活化，而是免疫重塑和免疫抑制微环境，因为高风险组检查点基因高表达且TIDE功能障碍/排斥评分高。免疫治疗预测需谨慎解释，因为胶质瘤中髓系抑制、T细胞耗竭和血脑屏障等因素影响检查点阻断效果。TMB/MSI整合分析显示风险评分提供超越基因组不稳定性的额外信息。LYRM4-AS1功能实验支持其驱动胶质瘤进展，但直接分子机制尚待明确，未来需研究亚细胞定位、RNA结合蛋白、ceRNA网络及与棕榈酰化酶的相互作用。局限性包括回顾性数据来源、缺乏大样本前瞻性验证、计算预测需实验验证、IMvigor210非胶质瘤特异性，以及LYRM4-AS1与棕榈酰化信号之间的直接关联未解决。
研究结论：研究人员开发并验证了一个六-lncRNA棕榈酰化相关特征，该特征可预测胶质瘤预后并反映免疫和治疗特征。风险评分与总生存期独立相关，并与细胞外基质重塑、神经活性信号、免疫浸润、免疫检查点表达、TIDE评分、TMB/MSI状态及预测药物敏感性相关。临床验证证实了模型的预后价值。功能实验证明LYRM4-AS1敲低抑制胶质瘤细胞恶性表型和异种移植瘤生长。这些发现将PRlncRNAs确定为神经肿瘤发生、分子信号和免疫重塑交叉处的生物标志物，并将LYRM4-AS1列为胶质瘤的候选功能靶点。
