《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Breaking the proteasome balance: α-synuclein and the ubiquitin-proteasome system
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衰老是突触核蛋白病（synucleinopathies）的主要风险因素，这些疾病包括帕金森病（Parkinson's disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies）和多系统萎缩（multiple system atro
衰老是突触核蛋白病（synucleinopathies）的主要风险因素，这些疾病包括帕金森病（Parkinson's disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies）和多系统萎缩（multiple system atrophy）。然而，将衰老与α-突触核蛋白（α-Synuclein，αSyn）细胞毒性联系起来的分子机制仍未完全阐明。蛋白质稳态（proteostasis）的进行性衰退是这些机制中的核心，因为泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway）无法维持易聚集蛋白的周转。在本综述中，研究人员聚焦于αSyn与蛋白酶体之间的双向串扰（bidirectional crosstalk），将其视为突触核蛋白病中蛋白质稳态崩溃的关键驱动因素。蛋白酶体活性随衰老而下降，蛋白酶体功能障碍与疾病进展密切相关。研究人员首先讨论了αSyn的结构和翻译后修饰（posttranslational modifications，PTMs）如何决定该蛋白是被UPS或自噬靶向降解，还是反而充当蛋白水解抑制剂。接下来，讨论了致病性αSyn物种与20S/26S蛋白酶体相互作用并损害其功能、影响蛋白水解活性、亚基组成和复合物组装的机制。这些相互作用建立了蛋白酶体抑制与αSyn积累的自我放大循环。因此，细胞清除错误折叠蛋白的能力逐渐下降，促进毒性αSyn聚集和神经退行性变。研究人员进一步讨论了自噬在αSyn周转中的重要性及其在突触核蛋白病中受损的方式。最后，研究人员强调了旨在恢复蛋白酶体功能和蛋白质稳态的新兴治疗策略。更深入地理解αSyn-蛋白酶体相互作用在衰老过程中的变化，可能揭示新的分子靶点，并支持开发针对突触核蛋白病的疾病修饰疗法。
1 引言
维持蛋白质稳态是细胞功能和生存的关键前提。蛋白质稳态包括蛋白质的合成、折叠、定位和降解的调控。衰老导致关键细胞过程的崩溃，即所谓的衰老标志（hallmarks of aging）。蛋白质稳态丧失、自噬紊乱和线粒体功能障碍是衰老过程中逐渐受损的关键代谢过程。由此导致的细胞稳态受损引发活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累、错误折叠和聚集蛋白蓄积以及基因表达改变等细胞异常。
与年龄相关的疾病，包括帕金森病（PD），与细胞稳态衰退密切相关。在PD中，衰老与疾病最显著的联系是聚集的α-突触核蛋白（αSyn）的积累。在生理条件下，这种小型天然未折叠蛋白有助于突触前末梢的囊泡运输和融合，从而支持神经递质释放。αSyn还与轴突囊泡运输、线粒体稳态、转录调控及通过组蛋白相互作用进行表观遗传调控有关。因此，其异常积累有可能破坏多个细胞过程，这些过程同时反映已确立的衰老标志。病理αSyn并非影响单一途径，而是影响多个相互关联的细胞过程，这些过程共同决定蛋白质组完整性和神经元活力。聚集的αSyn损害自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS），这是负责清除错误折叠、受损和积累蛋白质的两大蛋白水解途径。蛋白质降解系统的抑制加剧αSyn聚集成多态聚集体和淀粉样原纤维，这是PD及其他突触核蛋白病（如路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩（MSA））的标志。这种相互关系建立了一个自我推进的循环，其中蛋白质稳态受损促进αSyn积累，而αSyn丰度增加进一步损害细胞蛋白质降解途径。
αSyn聚集成淀粉样原纤维是一个漫长的多步骤过程，由无定形寡聚体的形成启动。这些细胞毒性组装体可作为形成高度有序淀粉样原纤维的种子结构，后者沉积为路易体（Lewy Bodies，LB），这是突触核蛋白病最显著的组织学标志。有趣的是，不同突触核蛋白病之间淀粉样原纤维的结构存在差异，凸显了这一疾病群体内部的多样性。越来越多的结构证据表明，不同的αSyn构象体不仅在结构上存在差异，其生化特性和细胞毒性也不同。
聚集的αSyn物种不仅具有细胞毒性，还干扰蛋白质降解途径。在生理条件下，αSyn稳定可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白SNAP29，促进囊泡融合。αSyn水平升高会降低SNAP29丰度，从而损害自噬体-溶酶体融合和自噬流。自噬缺陷因omegasome形成受损而加剧，导致自噬体减少。同时，病理αSyn通过多种机制损害UPS，包括26S组装缺陷、蛋白酶体亚基丰度改变、催化活性降低以及与蛋白酶体亚基直接相互作用。此外，与UPS调控相关的基因突变，包括家族性PD病例中的PARK2和PARK15，进一步支持UPS功能障碍在帕金森病发病机制中的相关性。
2 帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白
αSyn是一种140个氨基酸的蛋白质，在生理条件下以天然未折叠状态存在于细胞质中。PD的关键病理标志是聚集的αSyn物种（包括淀粉样原纤维）沉积为路易体（LB）或路易神经突（Lewy neurites，LN）。它属于突触核蛋白家族，该家族还包括β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。
2.1 α-突触核蛋白的序列与结构
αSyn在生理条件下与膜相互作用时采用α-螺旋二级结构，有助于囊泡融合。在病理状态下，αSyn发生构象错误折叠，形成富含β-折叠的结构，使其易于聚集。αSyn与膜相互作用的能力基于七个不完全的载脂蛋白-脂质结合基序（APO），这些基序在与膜相互作用时折叠成两亲性螺旋。七个APO重复序列中有五个位于蛋白质的两亲性膜结合N端。非淀粉样β组分（NAC）结构域和酸性C端不参与膜相互作用。许多疾病相关突变导致N端氨基酸替换。大量缬氨酸和丙氨酸残基导致αSyn的NAC区域高度疏水。这种疏水性是蛋白质错误折叠为病理β-折叠结构的关键驱动因素。C端在生理膜结合α-螺旋和病理β-折叠中均保持未折叠状态。虽然C端不形成淀粉样核心，但富含影响聚集倾向和降解的翻译后修饰（PTMs）。
2.2 α-突触核蛋白的翻译后修饰
PTMs在αSyn中分布不均。泛素化位点主要集中在蛋白质的N端区域，而NAC区域的PTMs相对较少，S87磷酸化/硝化及若干O-GlcNAc糖基化位点除外。酸性C端高度修饰，包含多个磷酸化、硝化位点以及能够接受小泛素样修饰物（SUMO）的残基。
磷酸化是与PD相关的αSyn PTMs中研究最深入的之一。已鉴定出四个磷酸化酪氨酸残基（pY39/125/133/136）和两个磷酸化丝氨酸残基（pS87/129）。尤其是pS129受到特别关注，因为该残基在PD、多系统萎缩及其他突触核蛋白病患者大脑中大量磷酸化，而在健康对照中仅检测到低水平。尽管pS87或pS129在具有αSyn病理的细胞中水平显著升高，但磷酸化的αSyn通常较不易聚集。这一矛盾表明，至少某些磷酸化事件可能发生在初始聚集之后，或限制进一步的原纤维生长，而非阻止最初的成核步骤。残基特异性磷酸化通过不同机制调节αSyn聚集。S129磷酸化发生在聚集之后，似乎降低进一步αSyn积累的可能性。S87磷酸化可能阻止原纤维化。Y39磷酸化降低αSyn聚集倾向并促进部分螺旋构象。类似地，pY125表现出减少的聚集。Y136磷酸化也阻止聚集，而pY133对聚集的影响尚不清楚。磷酸化不仅调节αSyn的聚集倾向，还显著影响其降解。pS129优先被蛋白酶体降解，并可增强自噬清除。αSyn在Y136处的酪氨酸磷酸化促进溶酶体降解及与热休克蛋白70的关联，而Y39及较小程度Y125的磷酸化损害αSyn的溶酶体和蛋白酶体降解。
除磷酸化外，αSyn在氧化和亚硝化应激条件下经历酪氨酸硝化。活性氮物种（reactive nitrogen species，RNS）可以硝化与磷酸化靶点相同的酪氨酸残基（Y39、Y125、Y133和Y136），形成3-硝基酪氨酸。在PD中，线粒体功能障碍、ROS积累和一氧化氮合酶活性增加可促进这种修饰。硝化的αSyn表现出增加的原纤维形成倾向和受损的蛋白酶体降解，进一步加剧蛋白质积累和聚集。C端硝化也与通过自噬增强αSyn包涵体的清除有关。有趣的是，Y133的硝化或磷酸化是S129磷酸化的前提条件，从而影响αSyn聚集和降解。
NAC区域还包含几个O-连接的β-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc糖基化）修饰位点。在九个已描述的糖基化位点中，八个是苏氨酸残基，加上前述的S87。αSyn的糖基化不显著改变其单体结构，但降低其聚集倾向和神经元毒性。非酶促糖化（glycation）是还原糖与含游离氨基的氨基酸共价结合的过程，N端赖氨酸残基的非酶促糖化降低脂质结合、增强聚集并加重突触核蛋白相关表型。
蛋白质的泛素化是确保正确蛋白质定位的关键机制。K48连接的聚泛素经典地与蛋白酶体降解相关，而K11、K27和K29连接也可促进蛋白酶体靶向。单泛素化和短的K48或K63连接泛素链也可能作为自噬信号。αSyn包含多个泛素化位点，主要在其膜相互作用的N端区域。SIAH-1和SIAH-2 E3泛素连接酶在K10、K12、K21、K23、K34、K43和K96残基处单泛素化αSyn。单泛素化αSyn已在路易体和路易神经突中检测到。E3连接酶NEDD4和NEDD4-1通过K63连接的聚泛素链在K12、K21、K45、K58、K60和K96残基处多聚泛素化αSyn，促进蛋白质摄取和降解。SCF-FBXL5连接酶复合物可将K48/K63分支泛素链添加到纤维状αSyn上，促进通过溶酶体和蛋白酶体途径的降解。M1残基的泛素化涉及线性泛素链，LUBAC复合物招募NEMO蛋白在M1处泛素化αSyn聚集体，促进其溶酶体降解。
SUMO化增加了另一层调控。αSyn包含几个SUMO化赖氨酸残基，其中K96和K102尤为重要。早期研究表明SUMO化减少原纤维形成和细胞毒性。然而，最近的研究将SUMO化视为病理驱动因素。在大鼠脑提取物中，αSyn的SUMO化阻断其单泛素化，从而减少蛋白酶体降解，而SUMO阻断多聚泛素化则干扰自噬。此外，SUMO化的αSyn更容易从细胞中输出，可能促进病理传播。
3 泛素-蛋白酶体系统
3.1 蛋白酶体的结构与组装
26S蛋白酶体是真核细胞中负责选择性降解泛素化蛋白的主要ATP依赖性蛋白水解复合物。它由一个中央20S核心颗粒（core particle，CP）和一或两个19S调节颗粒（regulatory particle，RP）组成。CP由四个堆叠的七元环组成：两个外α环调节底物进入，两个内β环包含催化位点。蛋白水解由β1、β2和β5亚基介导，分别提供半胱天冬酶样、胰蛋白酶样和糜蛋白酶样活性。20S核心颗粒的组装是由几个专用伴侣协调的多步骤过程。α环的组装始于PAC3/4伴侣复合物招募α5和α6亚基，随后依次加入所有七个α亚基以及PAC1/2异二聚体伴侣。随后，β亚基以确定顺序添加到α环，从与hUMP1相关的β2开始，形成13S半蛋白酶体。两个半蛋白酶体二聚化产生未成熟的前全蛋白酶体，去除组装伴侣后产生成熟的20S蛋白酶体。
19S RP由基部和盖子亚复合物组成。基部包含六个AAA+ ATP酶（PSMC1–6），驱动底物解折叠和转运进入CP，以及参与结构支架（PSMD1）和泛素识别（PSMD2和ADRM1）的额外亚基。盖子复合物包含重要的去泛素化亚基PSMD14，主要由结构亚基组成。19S RP的组装需要多个RP组装伴侣（RACs）指导四种不同中间基部组装体的形成。相比之下，盖子从两个独立形成的前体复合物组装，不需要伴侣。功能性26S蛋白酶体的形成依赖于20S CP的α环与19S RP基部之间的相互作用，这些相互作用由几个PSMC亚基和其他蛋白酶体激活因子中存在的保守C端HbYX基序介导。
3.2 蛋白质的泛素化与降解
靶向UPS降解的蛋白质通过被26S蛋白酶体识别的特定泛素化模式标记。K48连接基序的蛋白质多聚泛素化是蛋白酶体蛋白降解最常见的信号。泛素化由泛素激活（E1）、结合（E2）和连接（E3）酶的连续作用介导。E3连接酶基因PARK2（Parkin）和PARK15的突变与家族性帕金森病相关，将UPS功能障碍与PD发病机制联系起来。E3连接酶分为三个主要家族：RING、HECT和RBR连接酶，它们在泛素转移机制上有所不同。Parkin属于RBR家族。有效的蛋白酶体降解还需要底物蛋白内可接近的未结构化区域，该区域可以接合19S调节颗粒的AAA+ ATP酶马达。泛素化底物被19S调节颗粒的几个受体识别，包括PSMD2、PSMD4和ADRM1，随后被PSMD14或相关去泛素化酶去泛素化。在20S核心颗粒内，蛋白水解由三个催化β亚基介导。
除泛素依赖性蛋白酶体降解外，蛋白质还可以通过20S蛋白酶体进行不依赖泛素的降解。大约20%的细胞蛋白质组估计不依赖泛素化进行处理。20S蛋白酶体可以降解内在无序蛋白，如αSyn。20S蛋白酶体经常与PA200或PA28等蛋白酶体激活因子结合，这些激活因子诱导α环孔复合物的部分门打开以调节底物进入。PA200及其酵母直系同源物Blm10与几种神经退行性疾病相关蛋白的降解有关，包括突变亨廷顿蛋白、tau-441和αSyn。
4 α-突触核蛋白既是蛋白水解系统的底物又是抑制剂
4.1 α-突触核蛋白的降解
错误折叠和聚集的αSyn积累反映了突触核蛋白病中的蛋白质稳态功能障碍，并直接导致PD中的细胞毒性。在生理条件下，细胞依赖自噬和UPS作为主要蛋白水解系统。αSyn周转由两种途径的协调作用维持，任一途径受损都会促进毒性αSyn物种的积累并建立蛋白毒性应激的自我放大循环。UPS主要降解单体、可溶性αSyn，而自噬通常被认为在清除αSyn寡聚体和聚集体方面更有效。在生理条件下，单体αSyn存在于细胞内，而聚集αSyn物种的存在已表明向病理的转变。小于150个氨基酸的蛋白质，包括αSyn，可以在单泛素化后由蛋白酶体降解。然而，这种信号并非普遍存在，因为泛素化的具体位点显著影响降解效率。靠近N端的泛素化赖氨酸残基（K6、K12、K23、K32）与靠近C端的残基相比，促进更有效的蛋白酶体降解。αSyn是泛素非依赖性降解的理想底物，因为它相对较小且高度无序。体外实验表明，αSyn可以在没有事先泛素化的情况下被20S蛋白酶体降解。最近的工作支持这一观察，表明体内和体外20S蛋白酶体都可以周转αSyn。如果20S核心颗粒被蛋白酶体相互作用蛋白Blm10/PA200加帽，这种降解更有效。
除蛋白酶体降解外，单体αSyn还可以通过不同的自噬途径降解。UPS和自噬协同工作，能够在蛋白毒性应激或蛋白水解受损期间相互补偿。自噬是一种进化上保守的过程，可分为巨自噬、分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）和微自噬。其中，CMA是神经元中可溶性αSyn单体降解的主要途径，因为C端区域存在KFERQ样基序95-VKKDQ-99。寡聚αSyn能够阻断UPS和CMA。αSyn寡聚体不代表不同的生化实体，而是包含在大小、稳定性、表面疏水性和毒性方面显著不同的异质组装群体。寡聚体需要通过自噬或26S蛋白酶体从细胞中清除。αSyn积累诱导聚集自噬（aggrephagy）作为通过自噬清除蛋白质聚集体的过程。用αSyn预形成原纤维（PFF）处理人类细胞揭示，完全形成的αSyn原纤维的清除对细胞来说是有问题的，导致自噬和UPS的短暂抑制。αSyn原纤维的降解主要发生在胶质细胞中。近年来，一种新颖但不太常见的过程已被记录：外泌体（exophers）的排出，代表细胞摆脱毒性聚集体的替代途径。
4.1.1 α-突触核蛋白作为蛋白水解抑制剂
据报道，PD相关蛋白αSyn在聚集的各个阶段损害两种主要蛋白水解途径。蛋白酶体的抑制通过多种机制发生，而自噬则通过抑制自噬体形成或干扰自噬体成熟及其与溶酶体的融合而受损。PD患者死后大脑的分析为功能障碍的巨自噬和分子伴侣介导的自噬提供了证据。SNCA基因过表达抑制Rab1a，导致Atg9错误定位，从而损害自噬体形成。A30P αSyn突变体观察到更广泛的抑制，导致LC3水平降低。病理αSyn对自噬体运输和自溶酶体融合的干扰已被广泛研究。囊泡融合能力降低部分归因于αSyn水平升高时SNARE蛋白SNAP29水平降低。αSyn稳定肌动蛋白细胞骨架，特别是F-肌动蛋白，损害自噬体成熟、运输和与溶酶体的融合。
自噬的丧失与蛋白酶体的同时抑制相叠加，大幅降低细胞的蛋白水解能力。大量研究支持不同αSyn物种存在时蛋白酶体活性显著丧失。聚集的αSyn是26S活性的有效抑制剂，而对20S活性的抑制作用远不那么有效。体外实验中，聚集的αSyn在亚纳摩尔浓度下抑制泛素依赖性和非依赖性26S活性。寡聚αSyn、Aβ和亨廷顿蛋白是20S蛋白酶体活性的强抑制剂，特别是糜蛋白酶样活性。A11抗体识别几种与神经退行性疾病相关的淀粉样蛋白的寡聚组装体，支持淀粉样蛋白之间共享基序的想法。αSyn的C端区域在蛋白酶体抑制中起主要作用。不同αSyn原纤维的C端保持未折叠的“模糊外套”，根据C端对蛋白酶体相互作用的可及性差异抑制蛋白酶体活性。αSyn与蛋白酶体亚基的直接相互作用已被长期研究。αSyn与核心颗粒的α环蛋白PSMA3相互作用。
