利用环境RNA提高水生系统中鱼类检测灵敏度

《Methods in Ecology and Evolution》：Enhanced fish detection sensitivity in aquatic systems using environmental RNA

　　

环境RNA（eRNA）有可能增强已建立的环境DNA（eDNA）应用在保护中的生物学监测能力。尽管降解更快，环境RNA可能提供独特优势：它可能有助于减少与eDNA相比的遗留信号，通过基因转录提供生理状态的见解，并由于某些基因因生理和环境背景而固有的扩增而提供更高的检测灵敏度。

本研究调查了eRNA在野外检测鱼类的实际应用和灵敏度：一种濒危淡水鱼在一条季节性溪流中的全年情况，以及一种具有商业利益的远洋鱼类在海洋中的情况。研究人员开发了可行的现场采样和实验室方案，用于eRNA的保存和提取，解决了其自然不稳定性的挑战。随后，研究人员比较了使用物种特异性数字PCR（dPCR）检测两个线粒体基因的灵敏度：cytb基因（eDNA）/cytb转录本（eRNA）和12^S rRNA基因（eDNA）/12^S rRNA产物（eRNA）。

结果表明，12^S rRNA（eRNA）的浓度更高，表明其在检测低丰度生物方面具有优越性，同时提供了关于来自主要细胞途径（细胞色素b）的eRNA转录本数量的经验信息。重要的是，在淡水系统中，eRNA和eDNA浓度遵循相似的模式，反映了影响水中核酸浓度的水文条件变化。

这些发现强调了标记选择在eRNA研究中的重要性，核糖体基因相比其eDNA提供了增强的灵敏度。这项研究为基于eRNA的生物监测提供了对时间和空间动态、采样策略和分子靶标的见解。它展示了eRNA通过提供更准确的现存生物群落快照，并为其研究目标生物生理状态的潜力铺平道路，从而改善濒危物种检测并为保护工作提供信息的潜力。

环境DNA（eDNA）监测已在保护生物学中广泛应用，但eDNA在环境中具有较长的持久性，可能产生源于历史遗留群落的信号，难以准确反映现存物种。环境RNA（eRNA）由于降解更快，能够提供更接近采样时刻的生物存在快照，且某些基因的转录本拷贝数可能远高于其DNA模板，从而有望提高低丰度物种的检测灵敏度。然而，eRNA在自然生态系统中尚缺乏成熟的野外保存与提取方案，其实际应用仍处于实验阶段。为此，研究人员开展了这项研究，旨在开发可行的eRNA野外采集与实验室方法，检验eRNA能否比eDNA更灵敏地检测野生鱼类，并验证其作为物种监测指标的潜力。研究选取西班牙Duero流域Arganza溪流中的濒危鲤科鱼类Achondrostoma salmantinum以及美国太平洋沿岸的太平洋鳕鱼（Merluccius productus）作为目标物种，在淡水季节性溪流和海洋环境中进行全年或跨区域采样。研究结果显示，核糖体eRNA的浓度显著高于对应的eDNA，而信使eRNA（cytb转录本）浓度低于eDNA，表明标记选择至关重要。eRNA与eDNA浓度在淡水系统中表现出相似的季节动态，并与水文条件相关。在海洋样本中，eRNA同样提高了检测灵敏度。该研究证明了eRNA作为生物监测工具的可行性，并为濒危物种保护提供了更准确的现存群落信息。论文发表在《Methods in Ecology and Evolution》。

研究人员构建了便携式原位过滤系统用于现场水样过滤。淡水样本采自Arganza溪流两个位点（La Cespedosa和Los Caozos），共66份≤1 L水样，滤膜分别保存于Longmire裂解缓冲液（DNA）和DNA/RNA Shield（RNA）。海洋样本共20份2.5 L水样，采自美国俄勒冈和华盛顿州外海的CTD玫瑰花结Niskin瓶，过滤后保存。RNA采用Qiazol有机提取，DNA采用酚-氯仿-异戊醇提取，并经DNase处理去除残留DNA。使用物种特异性引物和TaqMan探针在QuantStudio Absolute Q数字PCR平台上进行检测，eRNA采用一步法逆转录数字PCR。同时利用MiFish引物进行12S rRNA宏条形码分析群落组成，并结合水文数据评估环境因子。

研究结果如下：

3.1 eDNA and eRNA purification（eDNA和eRNA纯化）：通过RNA完整值（RIN）评估，淡水样本的RIN大多在5以上，表明RNA质量可接受。部分样本出现降解，但DNase处理确认无残留DNA污染。

3.2 Community composition and dPCR validation（群落组成和dPCR验证）：宏条形码分析显示目标种A. salmantinum为优势种，同时存在其他原生种和入侵种。体外特异性测试显示引物和探针特异性良好，阴性对照低于检测阈值。

3.3 dPCR in freshwater fish（淡水鱼中的dPCR）：全年所有淡水样本均检出目标DNA或RNA。12^S rRNA eRNA浓度比其eDNA高最多两个数量级，而cytb eRNA浓度低于eDNA。eDNA和eRNA浓度呈正相关（12^S r²=0.69，cytb r²=0.64）。浓度高峰出现在5-6月和9-11月，分别对应繁殖期和干旱低流量期，且与溪流流量呈反比。

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