利用1H检测的17O和14N固体核磁共振波谱阐明茶碱共晶体中的氢键网络

《Physical Chemistry Chemical Physics》：Elucidation of hydrogen bonding networks in theophylline cocrystals by 1H-detected 17O and 14N solid-state NMR spectroscopyOpen Access

　　

确定药物共晶体中的氢键网络和质子位置仍然具有挑战性，特别是对于微晶材料和涉及强氢键及部分质子转移的系统。在此，本研究展示了一种结合快速魔角旋转（MAS）固态核磁共振（SSNMR）与1H检测的17O→1H和1H{14N}异核相关实验的策略，用于直接探测茶碱-羧酸共晶体中的氢键相互作用。通过在温和条件下与17O富集水进行同位素交换，实现了对羧酸共形成物（苯甲酸、草酸、马来酸和丙二酸）的简便17O富集。同位素交换反应可以很容易地通过17O溶液核磁共振波谱进行监测。使用可变偶极重耦时间记录的二维17O→1H D-RINEPT和1H{14N} D-HMQC谱图能够归属重叠的1H共振，并提供茶碱与羧酸共形成物之间分子间氢键的位点特异性识别。高磁场SSNMR实验（高达25.8 T）进一步增强了17O谱分辨率，并能分辨与不同羟基、羰基和动态交换氧环境相关的重叠17O共振。互补的1H自旋扩散和偶极双量子实验证实了分子间接触并确认了共晶体的形成。实验获得的17O和14N固态核磁共振参数与包含投影缀加波（GIPAW）密度泛函理论（DFT）计算结果吻合良好。这些结果共同建立了一种实用的多核SSNMR方法，用于鉴定药物共晶体及其他多组分有机固体中的氢键网络。

论文解读：利用多核固体核磁共振技术解析茶碱共晶体氢键网络

一、研究背景与科学问题

在药物开发领域，活性药物成分（API）的固体形态选择至关重要，直接影响药物的生物利用度、稳定性和可专利性。药物共晶体作为一种由API与药学上可接受的共形成物通过非离子型分子间作用力（主要是氢键）形成的多组分结晶固体，已成为拓展药物固体形态空间的重要策略。然而，精确表征共晶体中的氢键网络，特别是区分共晶体与盐（涉及质子转移）以及准确定位质子位置，一直是极具挑战性的难题。传统的X射线衍射（XRD）技术虽然广泛用于固体表征，但对于微晶粉末样品、无定形药物形式或制剂中的API常常无能为力。即便获得了单晶结构，由于氢原子对X射线的散射能力极弱，准确确定质子位置也十分困难。因此，发展一种能直接、灵敏地探测氢键相互作用的分析方法至关重要。固体核磁共振（SSNMR）波谱因其对局部化学环境的敏感性而成为解决这一问题的有力工具。本研究旨在开发和验证一套结合快速魔角旋转（MAS）和¹H检测的多核（¹⁷O和¹⁴N）SSNMR方法，以直接阐明药物共晶体中的氢键网络，并以茶碱（theophylline）与四种羧酸的共晶体为模型体系进行示范。该研究发表于《Physical Chemistry Chemical Physics》。

二、关键技术方法

研究人员采用了以下几种核心技术方法：

1. 1.
   ¹⁷O同位素标记：通过¹⁷
   O富集水与羧酸共形成物（苯甲酸、草酸、马来酸、丙二酸）在温和条件下进行同位素交换反应，实现¹⁷O标记，并利用¹⁷O溶液NMR实时监测交换效率。
2. 2.
   快速MAS ¹H检测的异核相关SSNMR：采用¹⁷O→¹H D-RINEPT和¹H{¹⁴N} D-HMQC脉冲序列，结合SR4²₁对称性偶极重耦技术，在50 kHz MAS频率下获取二维异核相关谱，直接探测¹⁷O-¹H和¹⁴N-¹H的空间邻近关系。
3. 3.
   高场SSNMR：利用高达25.8 T的超高磁场增强¹⁷O谱的分辨率，以区分因化学位移各向异性和四极耦合导致的重叠共振信号。
4. 4.
   同核¹H相关实验：包括¹H自旋扩散（spin-diffusion）和¹H双量子-单量子（SQ-DQ）相关谱，用于验证分子内和分子间的质子-质子空间接近程度。
5. 5.
   平面波密度泛函理论（GIPAW DFT）计算：对¹H、¹⁷O和¹⁴N的NMR参数（化学位移、四极耦合常数C_Q、不对称参数η_Q）进行计算，辅助谱峰归属并验证实验结果。

三、研究结果

1. 羧酸的简便¹⁷O标记与原位溶液¹⁷O NMR监测

研究发现，通过加热或延长室温反应时间，草酸、马来酸、苹果酸和丙二酸在¹⁷O水中可实现60%-100%的同位素交换效率。苯甲酸的标记则需要更高的温度和酸催化。通过时间分辨¹⁷O溶液NMR谱，可以清晰地追踪草酸在50°C下数小时内完成的交换过程。对¹⁷O标记的草酸α-二水合物进行的2D ¹⁷O→¹H D-RINEPT实验成功区分了羰基氧（C═O）和羟基氧（C-O-H），并观察到它们与酸性质子及结晶水质子的相关性。

2. 茶碱-苯甲酸共晶体的SSNMR分析

通过2D ¹⁷O→¹H和¹H{¹⁴N}相关谱，研究人员明确了两种主要的氢键相互作用：一是苯甲酸的羧基羟基与茶碱的羰基氧之间的氢键；二是茶碱咪唑环上的NH与苯甲酸的羰基氧之间的氢键。¹H SQ-DQ实验进一步证实了这两种酸性/酰胺质子之间的空间邻近性。

3. 茶碱-草酸共晶体的SSNMR分析

对于双(茶碱)-草酸共晶体，研究发现草酸的羟基与茶碱的亚胺氮（N═）形成对称的OH···N氢键，其羧基质子共振出现在15.2 ppm。而茶碱咪唑NH则与未标记的茶碱羰基氧形成氢键，共振于13.7 ppm。在9.4 T下观察到的单一宽¹⁷O共振表明草酸羧基的羰基和羟基处于中等或快速的化学交换中，而在14.1 T下则能分辨出两个峰。

4. 茶碱-马来酸共晶体的SSNMR分析

马来酸的两个羧基不等价。一个形成分子间氢键（质子信号16.5 ppm），另一个形成分子内氢键（质子信号14.5 ppm）。通过高场（25.8 T）¹⁷O NMR，研究人员将谱图分解为三个区域：羟基氧（~170 ppm）、经历动态交换的氧对（~240 ppm）和羰基氧（~350 ppm）。温度依赖实验和QCPMG谱图证实了羧基的180°旋转导致的动态交换行为。¹⁷O→¹H D-RINEPT和¹H{¹⁴N} D-HMQC谱图提供了详细的氢键连接和空间邻近信息。

5. 茶碱-丙二酸共晶体的SSNMR分析

该体系结构最为复杂，不对称单元中含有两对独立分子（Z′=2）。通过组合多种NMR技术，研究人员解析了四个不同的羧基环境。发现两个主要的羟基质子共振（14.5 ppm和13.1 ppm），分别对应与茶碱亚胺氮和羰基氧成键的质子。¹⁷O EXSY实验直接观测到了羟基氧与羰基氧之间的化学交换（归因于羧基的180°旋转或互变异构）。通过与GIPAW DFT计算的对比，研究人员成功归属了所有分辨出的¹⁷O和¹⁴N共振信号。

四、总结与结论

本研究成功建立了一套基于¹H检测的¹⁷O和¹⁴N固态核磁共振波谱的综合策略，并将其应用于解析茶碱与四种不同羧酸（苯甲酸、草酸、马来酸、丙二酸）所形成共晶体的氢键网络。研究结果表明，结合快速MAS、高场、多维异核相关（如D-RINEPT和D-HMQC）以及同核¹H相关实验，能够直接、位点特异性地鉴定API与共形成物之间的分子间氢键，有效区分重叠的¹H共振，并能揭示羧酸基团中常见的动态交换过程（如180°旋转和互变异构）。此外，实验测得的¹⁷O和¹⁴N NMR参数（包括化学位移、四极耦合常数C_Q和不对称参数η_Q）与基于GIPAW方法的平面波DFT计算结果高度一致，这不仅验证了实验结果的可靠性，也证明了理论计算在辅助谱图解析方面的巨大价值。总而言之，这项工作确立了一种实用且强大的多核SSNMR方法学，为深入理解药物共晶体以及其他多组分有机固体中的氢键作用、质子化状态和动态行为提供了新的途径，对于药物固体形态的开发与表征具有重要意义。