工程化制备具有可调降解性与力学性能的柔性纳米纤维羟基磷灰石支架用于骨再生

《Small》：Engineering Flexible Nanofibrous Hydroxyapatite Scaffolds With Tunable Degradation and Mechanical Properties for Bone Regeneration

　　

尽管羟基磷灰石（HA）因其与天然骨高度相似的化学组成及优异的骨传导性而被广泛用于骨再生，但其与传统陶瓷材料一样，存在固有的脆性和低可吸收性等局限性。本研究旨在证明，利用陶瓷纳米纤维（NFs）作为结构构筑单元，可将传统脆性且难吸收的HA陶瓷转化为具有可调刚度和降解特性的柔性支架。该目标通过调节NFs质量以调控支架刚度与力学强度，并通过改变NFs合成时间以制备不同尺寸的纳米纤维从而影响降解行为来实现。所制备的柔性支架在湿态下的刚度范围为1–100 kPa，可调降解率介于10–32 wt.%之间。所得支架为力学传导（mechanotransduction）领域研究支架刚度对细胞行为的影响提供了一个新型平台。

研究背景与问题

骨缺损和骨折是全球面临的重大临床挑战，主要源于人口老龄化和骨质疏松等相关疾病。尽管骨具有内在再生能力，但当缺损过大或存在影响骨再生的病理状态时，这一过程会受损。自体移植物被认为是金标准，但来源有限且需二次手术；同种异体移植物和异种移植物存在疾病传播和免疫原性风险。因此，合成材料作为促进骨再生的支架被广泛探索，其中磷酸钙类材料尤其是羟基磷灰石（HA）因其化学组成与骨矿物相相似且具有优异骨传导性而备受关注。然而，陶瓷材料固有的脆性限制了其更广泛的临床应用。陶瓷脆性主要源于缺乏滑移机制和离子/共价键的刚性，且微观裂纹或孔隙等缺陷作为应力集中点促进裂纹扩展。利用陶瓷纳米纤维（NFs）是改善陶瓷脆性的有效途径，纳米纤维的小直径和高长径比使其能够通过沿纤维长度积累局部微小变形来承受弯曲和变形，从而制备具有改善柔性和适应性的纳米纤维支架。尽管已有研究探索HA NFs的合成及其在生物医学中的应用，但关于陶瓷纳米纤维支架的研究仍相对有限，现有研究或将纳米纤维与聚合物混合从而掩盖了陶瓷的独立效应，或仅评估单一支架条件，限制了对陶瓷纳米纤维真正潜力的全面理解。本研究旨在解决两个关键挑战：一是克服HA的固有脆性，开发柔性、无聚合物的HA纳米纤维陶瓷支架，并实现刚度和力学强度的可调性；二是研究如何利用NFs的引入来控制支架的降解行为。此外，具有可调刚度的HA纳米纤维支架在力学传导领域具有重要应用前景，因为底物刚度在调控细胞黏附、增殖、迁移和分化中发挥关键作用。

研究内容与结论

研究人员通过水热反应合成了HA NFs，并通过调节合成时间（2至24小时）控制纤维尺寸和微晶尺寸。研究发现，增加合成时间使纤维直径从6.20 ± 2.28 nm（2小时）增至15.76 ± 4.73 nm（24小时），纤维长度从0.72 ± 0.50 μm（2小时）延伸至数百微米。XRD分析确认所有衍射峰均属于六方HA（P6?/m），为纯相产物，且衍射峰随合成时间增加而变尖锐，表明微晶尺寸增大。油酸钠在引导纳米纤维生长中发挥关键作用，通过优先吸附在带正电的富钙{100}棱柱面上抑制横向生长，而带负电的{001}基面不结合带负电的油酸根，使轴向生长占主导，形成细长纳米纤维。研究人员采用冰模板法将NFs固结为三维支架，通过离心将NFs浓缩至规定体积，浇铸到孔板中冷冻干燥，随后浸入乙醇促进纤维物理聚集。反应产率随NFs合成时间增加而逐渐提高，仅合成超过12小时的NFs能获得接近理论值的支架重量。向NFs浆料中添加乙醇可显著提高产率，其机制是乙醇破坏油酸根头基周围的水化层，降低界面张力，促进NFs聚集。SAXS研究揭示了NFs在悬浮液中的超分子排列随合成时间、溶剂组成和稀释度的变化规律。在油酸根存在下，2小时NFs在低q值区域的线性斜率接近?1，符合一维细长物体特征；随着老化时间延长，斜率趋近?2和?3，表明结构逐渐致密化。在乙醇中，相关峰得以保留，表明纤维间介观相互作用基本不变；在水中，相关峰几乎消失，表明高介电常数水削弱了纤维间相互作用。

力学性能评估表明，通过调节纤维负载量（10至120 mg），支架的刚度和抗压强度在1至100 kPa范围内近线性增加，两者在对数坐标上呈线性关系。所有支架表现出高孔隙率（95%–99.5%）和显著的水吸收能力，轻质支架可吸收高达其干重40倍的水。支架在湿态下表现出60%–95%的弹性恢复率，随支架重量增加略有下降。2小时NFs制备的支架因长径比不足而表现出永久变形和恢复能力丧失，而4小时和24小时NFs制备的支架力学性能相当，表明合成过程中已达到足够高的长径比。研究人员进一步探索了两种后处理策略改善弹性恢复的变异性：高压灭菌处理（121°C，30分钟）促进水充分润湿纤维束，降低纤维间摩擦；热处理方法（300°C，1小时）在纤维束间形成可控密度的烧结颈，类似弹性体中的低密度交联点。两种处理均提高了支架弹性，且效果在轻质支架中更为明显。微结构评估显示支架具有典型的冰模板结构形态，孔隙互连尺寸集中在约40 μm，范围10至90 μm。μ-CT成像证实干燥支架可轻易变形并插入4 mm套管，湿态支架则能良好适应缺损腔体几何形状，确保与腔壁充分接触。

降解行为研究采用pH 5、37°C的加速降解试验模拟破骨细胞介导的酸性微环境。结果显示支架失重范围为10 wt.%至32 wt.%，最轻支架（LC）降解最多，归因于其更高的孔隙率和吸水能力。4小时NFs制备的支架比24小时NFs制备的支架更易降解，这与较小尺寸和较低结晶度相关。通过调节NFs合成时间而非支架质量来调控降解，具有保持支架初始力学性能的优势。降解后支架的3D结构基本保持完整，无显著结构坍塌，湿态支架在质量损失后仍保持力学性能，表明支架能在维持功能力学支撑的同时提供优于传统仿生陶瓷的降解能力。

关键技术与方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：水热合成法（以油酸钠为结构导向剂，200°C反应2–24小时）制备HA纳米纤维；透射电子显微镜（TEM）和高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）表征纤维形貌和生长方向；X射线衍射（XRD）分析物相纯度和微晶尺寸；小角X射线散射（SAXS）研究纤维悬浮液的超分子排列；冰模板法（冷冻干燥）固结三维多孔支架；乙醇诱导物理聚集提高产率；循环压缩力学测试（流变仪，7个循环，60%变形）评估湿态力学性能；高压灭菌和热处理后处理调控弹性；扫描电子显微镜（SEM）和X射线显微计算机断层扫描（μ-CT）表征微观结构和三维形态；加速降解试验（醋酸缓冲液，pH 5.0，37°C，8小时，每小时更换溶液）结合电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测定钙离子释放。

2.1 合成纳米纤维的表征

通过水热反应合成HA NFs，合成时间从2小时变化至24小时。TEM显示增加合成时间使纤维直径从6.20 ± 2.28 nm增至15.76 ± 4.73 nm，长度从0.72 ± 0.50 μm延伸至数百微米。HR-TEM证实纤维沿HA的c轴方向生长。XRD确认所有衍射峰均属于六方HA（P6?/m），为纯相产物，且衍射峰随合成时间增加而变尖锐，表明微晶尺寸增大。油酸钠通过优先吸附在带正电的富钙{100}棱柱面上抑制横向生长，使轴向生长占主导，形成细长纳米纤维。

2.2 三维支架的固结与表征

采用冰模板法将NFs固结为三维支架，通过离心浓缩NFs，冷冻干燥后浸入乙醇促进纤维物理聚集。反应产率随NFs合成时间增加而提高，添加乙醇可显著提高产率，其机制是乙醇破坏油酸根头基周围的水化层，降低界面张力，促进NFs聚集。SAXS研究揭示了NFs在悬浮液中的超分子排列随合成时间、溶剂组成和稀释度的变化规律，表明纤维间相互作用为弱且可逆的超分子缔合。

2.3 纳米纤维支架的力学与物理性能

通过调节纤维负载量（10至120 mg），支架的刚度和抗压强度在1至100 kPa范围内近线性增加。支架表现出高孔隙率（95%–99.5%）和显著的水吸收能力。湿态下支架表现出60%–95%的弹性恢复率。2小时NFs制备的支架因长径比不足而表现出永久变形，而4小时和24小时NFs制备的支架力学性能相当。高压灭菌和热处理两种后处理策略均提高了支架弹性。

2.4 纳米纤维支架的微观结构评估

支架具有典型的冰模板结构形态，孔隙互连尺寸集中在约40 μm，范围10至90 μm。μ-CT成像证实干燥支架可轻易变形并插入4 mm套管，湿态支架则能良好适应缺损腔体几何形状，确保与腔壁充分接触，这对骨再生中促进细胞浸润和组织整合至关重要。

2.5 纳米纤维支架的降解行为

加速降解试验显示支架失重范围为10 wt.%至32 wt.%，最轻支架降解最多，归因于更高的孔隙率和吸水能力。4小时NFs制备的支架比24小时NFs制备的支架更易降解，与较小尺寸和较低结晶度相关。通过调节NFs合成时间调控降解具有保持支架初始力学性能的优势。降解后支架的3D结构基本保持完整，湿态支架在质量损失后仍保持力学性能。

结论

本研究通过调节水热合成时间成功合成了尺寸可控的HA陶瓷纳米纤维，并通过冰模板法将NFs加工成具有不同性能的支架。通过调节NFs类型和浓度，获得了刚度范围为1–100 kPa、弹性恢复率超过60%的柔性陶瓷支架。高压灭菌和热处理等后处理方法进一步增强了支架弹性。降解试验证明可控制支架降解速率。本研究证明可从纳米纤维HA浆料制备具有可调力学性能和降解速率的柔性陶瓷支架，解决了传统HA陶瓷支架的固有脆性和有限降解性问题。这些新材料在骨再生领域具有重要前景，并为陶瓷基材料中的力学传导研究奠定了基础。该论文发表于《Small》。