《RSC Advances》：Controlled aqueous nanoassembly-driven fully automated Fmoc solid-phase peptide synthesis (SPPS) with in-water couplingOpen Access
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基于Fmoc的固相肽合成（SPPS）是现代肽制造的重要基础；然而其对N,N-二甲基甲酰胺（DMF）这一有毒且受环境监管溶剂的依赖，带来显著可持续性挑战。研究人员报道了一种受控水相纳米组装策略，可在水基缩合条件下实现全自动Fmoc-SPPS。由Fmoc保护氨基酸
基于Fmoc的固相肽合成（SPPS）是现代肽制造的重要基础；然而其对N,N-二甲基甲酰胺（DMF）这一有毒且受环境监管溶剂的依赖，带来显著可持续性挑战。研究人员报道了一种受控水相纳米组装策略，可在水基缩合条件下实现全自动Fmoc-SPPS。由Fmoc保护氨基酸形成的水相纳米组装体通过简易两步制备流程获得，可提供稳定且具反应性的缩合环境，并与自动化合成兼容。该方法在商品化肽合成仪上实施，应用于不同长度和序列复杂度的肽，获得可接受纯度产物。该平台还可用于超过30个残基的长链肽自动化合成，包括GLP-1（1–37），证明其适用于困难序列。据研究人员所知，这是最早采用水基缩合循环且不使用DMF的全自动Fmoc-SPPS平台之一。通过消除DMF并使用水与乙酸乙酯等环境友好溶剂，该方法为常规SPPS提供了实用且可持续的替代方案，推进了自动化肽合成中的绿色实践。
论文解读：受控水相纳米组装实现无DMF全自动Fmoc固相肽合成
研究背景方面，肽合成在药物研发中地位关键，但传统Fmoc固相肽合成（SPPS）高度依赖N,N-二甲基甲酰胺（DMF）。DMF因环境与毒理学影响，已在欧盟REACH法规下被列为有害物质并受到严格限制。现有水相肽合成方法常受限于反应效率及与普通Fmoc保护氨基酸构建块兼容性差；水溶性氨基酸衍生物虽可改善溶解，却存在稳定性差、缩合动力学慢、底物适用范围窄和粗肽质量下降等问题。因此，研究人员希望发展一种不使用DMF、可自动化、且能兼容常规Fmoc保护氨基酸的水相SPPS平台。该研究发表于《RSC Advances》。
主要关键技术方法方面，研究人员采用Fmoc保护氨基酸、有机碱与水形成两组分纳米组装体，临用前加入水溶性缩合剂形成三组分级组装体；使用Biotage Initiator+ Alstra微波肽合成仪实现机器人液体处理与微波辅助缩合；以TentaGel树脂（PEG接枝聚苯乙烯核树脂）为固相载体；Fmoc脱保护用20% 4-甲基哌啶（4-methylpiperidine）于乙酸乙酯（EtOAc）中进行；粒径用动态光散射（DLS）表征；产物用反相HPLC与电喷雾四极杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS）分析。
研究结果部分，引言指出，早期水分散纳米颗粒法需行星球磨、胶体稳定性差，难以自动化；后续水相纳米组装体保留非分子溶解异相状态，可提供反应性界面微环境，与本研究的均相增溶策略机制不同。
结果与讨论部分，首先制备Fmoc-Phe-OH与N,N-二异丙基乙胺（DIEA）两组分纳米组装体，动态光散射显示其具廷德尔效应和异质粒径分布；加入2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐（TBTU）后重组为更均匀组装态。研究人员在自动微波合成仪上用H-Gly-Rink amide TentaGel树脂测试，TBTU、TATU、TCTU、DMT-MM在水相中70 °C微波5分钟均可使茚三酮试验阴性，说明两步纳米组装策略保留速率加速效应且溶液稳定。
短肽模型中，亮氨酸脑啡肽酰胺（H-YGGFL-NH2）经全自动水相SPPS得到98%粗纯度，优于或等同于DMF常规法96%；TBTU/DIEA表现最佳，未检出明显消旋或四甲基胍基化副产物。
较困难序列中，P物质（H-RPKPQQFFGLM-NH2）因Pro-X-Pro与连续Gln初始脱保护不佳；改为反应容器内现混4-甲基哌啶与EtOAc后，粗纯度81%，主要副产物为Met氧化体与缺Gln缺失体，整体质量可与DMF法相比。
长链肽中，GLP-1（1–37）采用位置依赖性单/双缩合，His位用DMT-MM；水相粗纯度16%，与DMF法18%相当，缺失模式不同，证明全自动水相SPPS可拓展至30余残基肽。
结论部分翻译：本研究开发了不使用DMF、完全由水与其他环境友好溶剂如乙酸乙酯构成的Fmoc-SPPS全自动方法，是迈向更可持续SPPS的一步。该平台核心是水相纳米组装体，其通过简易稳健的两步制备实现高效成键并保持自动化的高反应性。该方法成功用于不同长度与复杂度肽，获得可接受纯度产物。据研究人员所知，本工作是实现长链肽水相缩合全自动SPPS的重要一步。尽管需进一步研究His/Cys消旋、Asp–Gly等天冬酰亚胺相关Asp/isoAsp异构化及水相中保护肽链聚集问题，该平台仍为可扩展可持续肽制造奠定基础。纳米组装反应环境作为水相异相条件下高效转化的通用策略，可为肽科学与更广合成方法学中的环境友好自动化方法提供基础。
讨论总结方面，研究人员强调纳米组装体兼具操作稳定性、反应性与合成仪兼容性，说明该无DMF平台具备稳健性、可扩展性与普适性。水相与DMF体系副产物谱不同，反映聚集与缩合动力学差异；长链合成中树脂来源信号提示长时间条件下可能发生部分树脂降解，需后续研究。该工作不是宣称全面超越常规SPPS，而是证明水相纳米组装路线可作为绿色自动化肽合成的可行替代基础。
