靶向合成苯并喹啉嵌入型候选化合物：抗菌潜力与计算机模拟见解

《RSC Advances》：Target-oriented synthesis of benzoquinoline-embedded candidates: antimicrobial potential and in silico insightsOpen Access

　　

以硫代卡巴肼（thiocarbohydrazone）骨架作为通用中间体，合成了一系列苯并[h]喹啉（benzo[h]quinoline）衍生物，用于构建多种含氮和含硫杂环，包括四嗪（tetrazine）、噻二唑（thiadiazole）、三唑（triazole）、吡唑（pyrazole）和噻二嗪（thiadiazine）结构单元。这些结构变异旨在探究杂环骨架对抗菌活性的影响，并鉴定有前景的先导化合物。研究人员评估了所合成衍生物对一组革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及白色念珠菌（C. albicans）的体外抗菌活性。抗菌评估采用琼脂孔扩散法（agar well diffusion）测量抑菌圈（inhibition zone, IZ），并采用肉汤微量稀释法（broth microdilution）测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。大多数化合物表现出中等至显著的活性，IZ值通常为9.0至16.0 mm。化合物14成为最有效的衍生物，显示出广谱活性，对测试菌株的抑菌圈最高达15.0 mm，MIC值范围为13.0至23.0 mg mL^?1，且具有显著的MBC值（20.0至35.0 mg mL^?1），使大多数测试菌株的每毫升培养物CFU降低，尤其是金黄色葡萄球菌（S. aureus）降至16.0 CFU mL^?1。化合物10和13也表现出显著活性，尤其对大肠杆菌（E. coli）和蜡状芽孢杆菌（B. cereus）。为合理解释所观察到的生物活性，研究人员以DNA旋转酶B（DNA gyrase B, PDB ID: 4KFG）为靶点，以新生霉素（novobiocin）为参考抑制剂，对化合物10、13和14进行了分子对接研究。对接结果表明，这些化合物在活性位点内具有有利的结合亲和力和关键相互作用，与实验活性趋势一致。分子动力学模拟进一步支持所选择的配体-蛋白质复合物具有时间依赖性稳定性。此外，ADME（吸收、分布、代谢、排泄）和BOILED-Egg分析强调化合物10是最具药代动力学优势的候选物，表现出亲脂性与极性之间的最佳平衡，并具有预测的高胃肠道吸收。相反，化合物13和14显示通透性降低，而庆大霉素（gentamicin）由于高极性而表现出较差的被动扩散。总之，这些发现确定基于苯并[h]喹啉的候选物，特别是化合物10，是进一步抗菌药物开发的有前景骨架。

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的全球性蔓延对现有治疗手段构成严峻挑战，迫切需要开发具有新骨架和新作用机制的抗菌药物。苯并喹啉（benzoquinoline）作为一类重要的含氮杂环化合物，因其独特的化学结构和广泛的生物活性，在药物化学领域备受关注。已有研究表明，喹啉及苯并喹啉衍生物具有抗癌、抗病毒、抗疟、杀虫和抗炎等药理活性，且苯并喹啉的毒性低于喹啉。此外，腙（hydrazone）和硫代卡巴肼（thiocarbohydrazone）骨架是公认的生物活性药效团，能够增强亲脂性并促进与微生物靶标的相互作用。近年来，含吡唑、三唑、噻二唑等杂环的喹啉类化合物的抗菌活性已被陆续报道。然而，将苯并喹啉核心与硫代卡巴肼及多种杂环体系结合，系统探究其结构对抗菌活性影响的研究仍相对有限。基于此，研究人员设计并合成了一系列以苯并喹啉-硫代卡巴肼为关键中间体的衍生物，通过引入不同类型杂环结构来增强抗菌潜力，并结合计算模拟从分子层面阐明其可能的作用机制。该研究发表于《RSC Advances》。

研究人员首先以2-氯苯并[h]喹啉-3-甲醛（2-chlorobenzo[h]quinoline-3-carbaldehyde）与硫代卡巴肼缩合得到中间体化合物3，再分别与乙酸酐、乙酸、异硫氰酸苯酯、4-甲氧基苯甲醛、丁炔二酸二甲酯、苯甲酰氯、2-溴-1-(3-硝基苯基)乙酮、靛红、3-乙酰香豆素及2-氯-N-(4-氨磺酰苯基)乙酰胺等亲电试剂反应，构建了四嗪、噻二唑、三唑、吡唑、噻二嗪等杂环衍生物（化合物4–14）。所有新化合物的结构均通过红外光谱（IR）、核磁共振氢谱（¹H NMR）和高分辨质谱（HRMS）等予以确认。抗菌活性评价采用琼脂孔扩散法测定抑菌圈（IZ），采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），并进一步测定最低杀菌浓度（MBC）。受试菌株包括革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli ATCC 25922）和幽门螺杆菌（H. pylori ATCC 43526），革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 6538）和蜡状芽孢杆菌（B. cereus ATCC 6629），以及真菌白色念珠菌（C. albicans ATCC 10231）。计算研究方面，研究人员以DNA旋转酶B（DNA gyrase B, GyrB，PDB ID: 4KFG）为靶点，对活性最高的化合物10、13和14进行了分子对接，并以新生霉素（novobiocin）为参考抑制剂；随后对上述复合物进行了100 ns的分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，评价其结合稳定性；最后利用SwissADME平台预测了化合物的药代动力学性质并进行了BOILED-Egg分析。

### Chemistry

化学合成部分详细描述了中间体3及衍生物4–14的制备过程和结构表征。中间体3由2-氯苯并[h]喹啉-3-甲醛与硫代卡巴肼在乙醇/乙酸中回流制得，收率91%。该中间体与不同亲电试剂反应，可分别生成单乙酰化产物4、四嗪衍生物5、噻二唑衍生物6、三唑衍生物7、腙衍生物8、吡唑衍生物9、噻二唑衍生物10、噻二嗪衍生物11、靛红腙衍生物12、香豆素腙衍生物13及三嗪衍生物14。通过IR、NMR和HRMS确证了各化合物的结构，例如化合物5的¹H NMR中CH═N信号消失，支持环化反应的发生；化合物10的HRMS测得[M ? H]^?为414.0586，与理论值一致。

### Antimicrobial assessment

#### Qualitative antimicrobial evaluation of synthesized derivatives using the well diffusion assay

采用琼脂孔扩散法对衍生物3–14进行了定性抗菌筛选。结果显示，大多数化合物表现出可测量的抗菌活性，IZ范围在9.0–16.0 mm之间。其中化合物10、13和14对全部测试菌株显示出最强的广谱活性，对E. coli、H. pylori、B. cereus、S. aureus和C. albicans的抑菌圈为12–15 mm。化合物14对E. coli和C. albicans的IZ为15.0 mm，对H. pylori和B. cereus为14.0 mm，对S. aureus为12.0 mm，与阳性对照庆大霉素（IZ 14.0–20.0 mm）相比，化合物10和14对部分菌株表现出接近或相当的活性。化合物11也显示出良好的抗菌和抗真菌活性（IZ 13.0–15.0 mm）。化合物3、4、6、8的活性较弱至中等，而化合物12对C. albicans显示出最好的抗真菌活性（IZ 16.0 mm），但对S. aureus无活性。

#### Quantitative antimicrobial determination of the most potent selected derivatives using minimal inhibitory concentration (MIC)

通过微量肉汤稀释法测定了代表性化合物的MIC值。化合物13表现出显著广谱活性，对E. coli和H. pylori的MIC为13.0 mg mL^?1，对B. cereus和C. albicans为15.0 mg mL^?1。化合物14对H. pylori的MIC为13.0 mg mL^?1，对E. coli、S. aureus和C. albicans的MIC为20.0–23.0 mg mL^?1，对B. cereus为15.0 mg mL^?1。化合物4、5、7、11和13的MIC介于18.0–37.0 mg mL^?1。虽然阳性对照庆大霉素的MIC值（0.083–0.25 mg mL^?1）远低于合成化合物，但合成衍生物仍显示出有希望的广谱抗菌潜力。对化合物10和14进一步测定MBC，结果显示二者对B. cereus均具有杀菌作用（MBC = 20 mg mL^?1），化合物14对H. pylori和S. aureus的MBC分别为20和30 mg mL^?1，且使金黄色葡萄球菌菌落数降至16.0 CFU mL^?1；化合物10对C. albicans的MBC为30 mg mL^?1，略优于化合物14（35 mg mL^?1）。这些结果表明化合物的杀菌效应具有菌株依赖性，10和14展现出互补的杀菌谱。

### Molecular docking studies

为解释活性化合物的抗菌机制，研究人员选择DNA旋转酶B（GyrB）作为潜在靶点进行分子对接。首先将共晶配体重新对接以验证方案可行性，所得RMSD较低且保留了关键结合特征。对化合物10、13和14的对接结果显示，其结合打分（S）分别为?7.05、?7.95和?8.08 kcal mol^?1，其中化合物14的打分与参考抑制剂新生霉素（?8.02 kcal mol^?1）相当。化合物10主要与Asp73和Arg136形成氢键；化合物13除Asp73外还与Arg76、Arg136相互作用；化合物14则表现出最多样的结合模式，包括与Asp101、Lys99的氢键以及Asn46、Ile78的π–H相互作用。这些残基与新生霉素及共晶配体的结合位点高度重叠，提示GyrB抑制可能是这些衍生物抗菌活性的潜在贡献因素，但仍需酶学实验验证。

### Molecular dynamic simulations

对10、13、14、新生霉素及重对接共晶配体的复合物进行了100 ns分子动力学模拟。RMSD分析表明所有复合物均达到平衡并保持稳定，其中化合物14具有最小且最稳定的蛋白质C_α RMSD（2.28 ± 0.18 ?）和最低的平均C_α RMSF（0.82 ± 0.46 ?）。蛋白质-配体接触直方图显示，化合物14在整个模拟中持续与Ala96、Lys99、Asn46、Ile78和His95等残基相互作用，其结合稳定性与对接预测一致。化合物10的配体RMSD最低（1.78 ± 0.54 ?），表明其初始结合取向保持较好。整体上，MD模拟支持活性化合物能够与GyrB形成稳定复合物，但该结果仍属计算预测，需通过生化实验确认直接酶抑制。

### ADME profiling and correlation with antimicrobial activity

利用SwissADME对化合物10、13、14及庆大霉素进行了药代动力学预测。化合物10的分子量为415 g mol^?1，拓扑极性表面积（TPSA）为94 ?²，consensus log P为5.40，预测具有高胃肠道吸收；化合物13和14分子量较高（500和506 g mol^?1），TPSA分别为124和151 ?²，吸收较低。庆大霉素的TPSA高达约199 ?²，log P为?2.15，极性极强，被动扩散差。化合物10、13、14均符合Lipinski规则，生物利用度评分为0.55，且不是P-糖蛋白（P-gp）底物，而庆大霉素有2项Lipinski违例且是P-gp底物。BOILED-Egg图显示化合物10位于白色（胃肠道吸收）区域，提示其具有最佳的被动吸收特性；化合物13和14因极性较高位于区域外；庆大霉素远离吸收区域。这些结果说明化合物10具有最优的药代动力学特征，与其广谱抗菌活性相一致。

### 讨论与结论

讨论部分指出，分子对接和分子动力学模拟为DNA旋转酶B作为潜在靶点提供了合理的分子假说，但最终的细胞应答还受膜通透性、胞内蓄积、外排行为、溶解性和稳定性等多因素影响，未来需通过GyrB酶抑制实验进一步验证靶点贡献。研究结论部分可翻译为：本研究表明，基于苯并[h]喹啉骨架并以硫代卡巴肼为合成子的化合物代表了具有广谱活性的有前景的抗菌候选物。在评估的化合物中，衍生物10和14表现出最强的抗菌效果，对包括E. coli、B. cereus、H. pylori和C. albicans在内的一系列病原体显示出较低的MIC值。这些发现强调了结构修饰，特别是杂环部分的引入，在增强抗菌效力中的关键作用。对化合物10、13、14与DNA旋转酶B活性位点（PDB ID: 4KFG）的对接研究揭示了与新生霉素及共晶配体相当的有益结合亲和力和相互作用模式。随后的分子动力学模拟支持这些配体-蛋白质复合物的时间依赖性稳定性，关键活性位点残基的持续相互作用支持GyrB结合是观察到的抗菌活性的可能原因。此外，ADME和BOILED-Egg分析强调化合物10是最具药代动力学优势的候选物，具有亲脂性与极性的最佳平衡、增强的膜渗透性和预测的高胃肠道吸收。总之，这些发现确定化合物10为具有改善的药物样性质和广谱抗菌潜力的特别有前景的候选分子。