3D生物打印海藻酸盐-明胶-胶原基水凝胶负载成纤维细胞和角质形成细胞显示出损伤皮肤再生的潜力

《Macromolecular Bioscience》：3D Bioprinted Alginate-Gelatin-Collagen Based Hydrogels Laden With Fibroblast and Keratinocyte Cells Show Potential for Regeneration of Injured Skin

　　

模拟皮肤细胞外基质的生物活性支架是目前科学研究的兴趣所在。本研究开发了负载人真皮成纤维细胞（HDFs）和原代表皮角质形成细胞（KCs）的复合生物聚合物打印支架，以生成可积极参与皮肤再生的构建体。研究人员将海藻酸钠（ALG）与CaCl₂部分交联，并与明胶（GEL）和胶原（COL）结合，以获得易于挤出的复合生物墨水。通过流变学优化了CaCl₂浓度（0.2–4.5% w/v）和生物墨水的理化性质，并通过降解研究优化了支架的稳定性。研究人员使用MTT和活-死实验评估了打印支架内的细胞活力（7天），同时通过免疫荧光成像确认了支架内HDFs/KCs的分层结构。用0.5% w/v CaCl₂部分交联的生物墨水在生物打印过程中具有最佳挤出性，而用1.5% w/v CaCl₂完全交联的支架在7天内保持了结构完整性和细胞活力，并具有适当的增殖和迁移。这是首次包含ALG-GEL-COL、负载HDFs和KCs并生物打印用于损伤后潜在皮肤再生应用的研究。生成的生物打印支架将有助于推动组织再生领域的发展，包括未来作为治疗性药物递送平台的潜力。

皮肤损伤后的再生需要恢复分层的皮肤细胞结构，维持细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用至关重要。传统皮肤组织构建方法如手动分配、冷冻干燥和颗粒浸出无法精确控制细胞在各自层中的空间排列，也难以构建接近ECM的复杂结构，且需要数周培养。3D生物打印技术能够将生物材料和细胞精确沉积为活体组织构建体，为皮肤再生提供了新途径。然而，理想的生物墨水需具备良好的可打印性、维持构建体完整性和机械稳定性，并支持细胞存活和分化。本研究旨在开发一种基于天然生物聚合物的复合生物墨水，用于负载人真皮成纤维细胞（HDFs）和原代表皮角质形成细胞（KCs）的3D生物打印，以生成可积极参与皮肤再生的构建体。研究人员将海藻酸钠（ALG）与CaCl₂部分交联，与明胶（GEL）和胶原（COL）复合，形成易于挤出的ALG-GEL-COL生物墨水。通过流变学优化交联剂浓度和生物墨水理化性质，通过降解研究优化支架稳定性，并通过MTT和活-死实验评估细胞活力，免疫荧光成像确认分层结构。该研究首次将ALG、GEL和COL三种聚合物组合并负载HDFs和KCs进行生物打印，为皮肤再生提供了更经济的自研生物墨水，未来可用于药物递送平台。

在关键技术方法方面，研究人员主要运用了以下方法：采用流变学测量比较不同CaCl₂浓度下生物墨水的粘度与商业生物墨水；通过降解实验观察支架在培养基中的稳定性；使用挤压式3D生物打印机（BIO X）构建双层支架；利用MTT法和活-死染色（钙黄绿素/DAPI）评估细胞活力；通过免疫荧光共聚焦显微镜观察细胞分布和迁移。细胞样本均购自ATCC，无患者队列。

研究结果如下：

3.1 流变学分析：通过测量不同CaCl₂浓度（0.2-1.2% w/v）下ALG-GEL-COL生物墨水的粘度，发现0.5% w/v CaCl₂交联的生物墨水粘度与商业生物墨水最接近，在0.1、1和10 s^?1剪切速率下分别为440,123、92,176和17,162 mPa·s，实现了可打印性与低剪切应力之间的平衡。

3.2 含细胞构建体的3D打印：利用0.5% w/v CaCl₂部分交联的生物墨水，成功打印了20 mm × 20 mm × 1 mm的双层支架，结构清晰、层间连接稳定，表明该生物墨水适合挤压式生物打印。

3.3 降解研究：将无细胞支架浸泡于不同浓度CaCl₂（0.5-4.5% w/v）后置于DMEM中14天，显示0.5%和1%交联的支架两周内降解，而1.5%及以上浓度交联的支架保持完整。综合考虑高浓度CaCl₂的潜在细胞毒性，选定1.5% w/v CaCl₂为最佳完全交联浓度。

3.4 CaCl₂对细胞活力的影响：MTT实验显示，在0.5% CaCl₂中，KC负载支架24小时和48小时活力分别为92%和95%，HDF负载支架分别为89%和92%；而在4.5%浓度下活力显著降低。经1.5% CaCl₂完全交联的共培养支架在7天内活力持续高于90%，表明生物墨水对两种细胞均具有良好的生物相容性。

3.5 活-死实验：共聚焦图像显示，共培养双层支架第7天细胞活力为96%，分层（单层KC/单层HDF）支架为98%。细胞数量从第1天到第7天倍增，证明细胞存活和增殖，且支架具有足够的营养扩散通透性。

3.6 免疫荧光研究：免疫荧光染色显示，共培养支架中两种细胞在7天内均增长并良好分布；分层打印支架中，第3天可见明显的KC层，至第7天细胞沿Z轴扩展，表明KCs和HDFs在支架内具有迁移能力。细胞呈圆形形态，表明生物墨水低粘附性，但有利于细胞自我组装和皮肤组织重建。

讨论总结：ALG在生理条件下逐步降解，为细胞提供空间；GEL和COL促进细胞粘附、迁移和增殖，共同增强组织再生能力。尽管生物墨水经高压灭菌，仍维持较高细胞活力，表明蛋白质组分保留了足够的生物功能。未来需延长培养时间并结合组织学分析，以确认全层皮肤结构的形成。

研究结论：该研究评估了由ALG、GEL和COL三种天然生物聚合物组成的复合生物墨水，用于3D生物打印，以构建负载HDFs和KCs的3D构建体，模拟人表皮/真皮皮肤层。最佳生物墨水为6% w/v ALG与GEL溶液和10% w/v COL溶液等体积混合，其流变学特性与昂贵的商业生物墨水相当，提供了更经济的自研选择。复合生物墨水及优化的打印条件温和，支持细胞存活，支架在生理培养基中稳定14天。免疫荧光证实KCs和HDFs的存在，且KC层在构建体顶部形成。结果表明ALG-GEL-COL适用于未来皮肤再生研究，但需更长时间的组织学表征以确认全层皮肤形成。