综述：氧化损伤RNA核苷酸的化学与生物学

《RSC Chemical Biology》：Chemistry and biology of oxidatively damaged RNA nucleotidesOpen Access

　　

氧化应激条件下的核酸损伤是一个已被充分确立的现象，与所有生物的进化相关。虽然DNA方面已得到深入研究，细胞RNA同样是广泛损伤的对象，其对外源因素和细胞代谢产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）具有相似的反应性。DNA和RNA氧化损伤的化学相当复杂，涉及多种伴随的化学反应，而次级反应进一步加剧了本已繁多的化学损伤核苷酸列表。损伤具有随机性，通常导致亚化学计量比的损伤位点，这大大增加了RNA氧化分析的复杂性。现代分析技术包括基于深度测序（deep sequencing）的方案，能够精确定位细胞RNA中的此类损伤残基。越来越多的实验证据表明其具有广泛而深远的生物学后果，并强调了氧化RNA代谢在各种细胞过程中的重要性。主要效应预计发生在翻译水平，因为翻译机制的所有关键参与者——mRNA、rRNA和tRNA——都是显著的氧化靶标。本综述介绍了研究人员在RNA氧化/损伤化学分析方面的当前成就、允许RNA氧化分析的传统和现代方法，以及目前对活细胞中RNA氧化生物学后果的看法。

**引言**

RNA氧化损伤虽与DNA和蛋白质氧化同样频繁，但在过去几十年中未得到充分研究。随着表观转录组学（epitranscriptomics）领域对RNA核苷酸化学修饰的关注，这一状况正在改变。本综述探讨氧化诱导RNA损伤的化学、当前用于分析氧化核苷酸的方法及其对生物过程的影响。RNA与DNA在化学上的相似性反映在两种核酸上检测到的许多核碱基氧化产物中，这为将DNA研究中已取得的成果合理外推至RNA提供了基础。然而，两者在细胞内的整体反应性和氧化生物学存在显著差异，这主要源于结构生物学差异以及RNA在细胞中浓度高得多、分布广泛且缺乏组蛋白保护。

**氧化应激**

从化学角度看，氧化应激被定义为活细胞中氧化剂与还原剂之间的失衡。外源因素包括电离辐射、光氧化和环境化学物；内源因素包括线粒体电子传递链（electron transport chain, ETC）及氧化还原酶如NADPH氧化酶（NOX）、黄嘌呤氧化酶（XO）、一氧化氮合酶（NOS）和髓过氧化物酶（MPO）。主要活性氧（reactive oxygen species, ROS）包括单线态氧（¹O₂）、超氧阴离子自由基（O₂˙^?）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（˙OH）、碳酸根自由基（CO₃˙^?）等。生理条件下Fenton反应主要产生CO₃˙^?而非˙OH，CO₃˙^?作为单电子氧化剂主要参与DNA和RNA中的鸟嘌呤氧化。HCO₃^?/CO₂同时具有保护性抗氧化作用，通过将Fenton反应产物从高活性˙OH转变为CO₃˙^?来减弱铁催化的核酸氧化。

**RNA对氧化损伤的易感性**

RNA因多为单链、缺乏组蛋白保护、定位于胞浆且靠近线粒体和内质网等ROS生成位点而特别易受氧化损伤。与DNA不同，RNA尚无复杂修复机制，细胞主要依赖监视途径如no-go decay（NGD）和nonsense-mediated decay识别并降解氧化RNA转录本。MTH1和NUDT5可水解氧化嘌呤核苷三磷酸（NTPs）为单磷酸，防止其掺入RNA。

**氧化RNA损伤的化学**

鸟苷因氧化还原电位最低（E₀(G) = 1.29 V）最易被氧化，主要产物包括8-氧鸟苷（oxo8G）、8-氧腺苷（oxo8A）、5-羟胞苷（ho5C）和5-羟尿苷（ho5U），其中oxo8G最为丰富。

**鸟苷氧化的机制、产物及生物学意义**

C8定向氧化途径产生oxo8G，其进一步氧化生成胍基海因（rGh）和螺亚胺二海因（rSp）；rSp在碱性条件占优，rGh在酸性环境及双链结构中占优。含还原剂条件下，同一C8-OH自由基中间体被还原并开环生成甲酰胺嘧啶（Fapy-G）。C5定向氧化途径产生5-羧酰胺-5-甲酰胺-2-亚胺海因（r2Ih），以及咪唑啉酮（rIz）和其水解产物噁唑酮（rZ）。活性氮物种（RNS）介导的硝化损伤中，过氧亚硝酸盐（ONOO^?）在生理pH下与CO₂反应生成CO₃˙^?和二氧化氮自由基（NO₂˙），后者主要产生8-硝基鸟苷（8-NO₂-G）。光氧化经I型（直接电子转移）和II型（单线态氧介导）机制进行。

**腺苷氧化反应**

腺苷氧化产生8-氧腺苷（oxo8A），其进一步氧化生成醌亚胺（iminoquinone）中间体，该强亲电物种可与水、外环胺、赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基反应，形成RNA-蛋白质交联。还原条件下形成Fapy-A。

**嘧啶氧化损伤**

5-羟胞苷（ho5C）和5-羟尿苷（ho5U）是主要嘧啶氧化产物；次氯酸（HOCl）氧化可生成5-氯胞苷（Cl5C）和5-氯尿苷（Cl5U）。

**核糖氧化与链断裂**

核糖C2′原子氧化可导致RNA链断裂，优先发生在双链RNA中，产物为5′-磷酸末端。

**化学氧化与天然RNA修饰的相互作用**

硫代尿苷衍生物（s2U、s4U、mnm5s2U）易发生氧化脱硫，如s2U被H₂O₂氧化生成4-嘧啶酮呋喃核糖苷（h2U）或尿苷，取决于pH。

**RNA脱碱基位点——化学视角**

rAP位点由N-糖苷键断裂形成，半缩醛胺型rAP核糖在呋喃糖半缩醛与开链醛形式间动态平衡，醛基可被亲核攻击形成席夫碱，导致链断裂或蛋白质交联。细胞色素c催化的氧化可诱导rAP形成并促进RNA-蛋白质交联。

**HOCl诱导RNA氧化的特殊化学**

HOCl（E₀ = 1.48 V）由MPO催化Cl^?氧化产生，通过嘌呤C8和嘧啶C5的氯化和氧化生成Cl8G、Cl8A、Cl5C、Cl5U及相应氧化产物，Cl5C和oxo8G已在HOCl处理的RNA中检测到。

**RNA氧化/损伤核苷酸的检测、定量和定位分析方法**

薄层色谱（thin-layer chromatography, TLC）结合³²P标记具有高灵敏度；高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）和LC-MS/MS可在fmol至attomol水平检测和定量氧化核苷酸，采用动态多反应监测（DMRM）或中性丢失扫描（NLS）模式；抗体富集法利用抗oxo8G抗体进行免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）；醛反应探针（aldehyde reactive probe, ARP）检测rAP位点；基于损伤核苷酸改变碱基配对特性的逆转录（reverse transcription, RT）引物延伸法用于rAP和oxo8G检测；荧光和自旋标记探针嵌入RNA:DNA双链可检测rAP位点；氧化残基可调节RNase T1、RNase A和Xrn-1等核酸酶的切割活性。

**通过深度测序定位RNA中氧化修饰残基**

MeRIP类方法结合抗oxo8G抗体和短读长测序可绘制转录组水平的RNA氧化图谱；RT签名分析（G→T突变）实现单核苷酸分辨率定位；ChLoRox-Seq利用生物素化伯胺化学标记oxo8G后进行富集和测序；AlkAnilineSeq和OxiAbSeq通过苯胺裂解rAP位点实现核苷酸分辨率检测。纳米孔测序可直接检测RNA修饰，有望用于RNA氧化分析。

**RNA氧化的生物学后果**

氧化损伤影响逆转录保真度，oxo8G和rAP可导致G→T突变，可能加速逆转录病毒突变积累。

**RNA氧化对翻译的影响**

mRNA氧化：oxo8G、oxo8A、ho5C、ho5U导致截短蛋白产物积累，rAP位点完全阻断翻译。oxo8G以syn构象与A错配，诱导核糖体停滞和新生蛋白链错误折叠。rAP位点在不同密码子位置对原核和真核翻译系统有差异化影响。

tRNA氧化：氧化应激导致特定tRNA选择性切割和丰度下降。s2U氧化产物h2U偏好与G配对，干扰摆动位点解码，影响氨酰化。

rRNA氧化：23S rRNA的修饰掺入研究表明，氧化损伤位置决定翻译影响，如A2451位oxo8A抑制转肽反应，U2585位ho5U阻碍tRNA容纳。

**受损ncRNA在细胞信号通路调控中的作用**

氧化修饰的miRNA（如miR-184、miR-1）可改变靶向特异性，错误识别抗凋亡蛋白mRNA，促进凋亡或心肌肥大。氧化和氯化的核苷酸及rNTPs可作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）激活天然免疫信号通路。低水平氧化应激诱导酵母25S rRNA特异性切割，触发适应性hormetic反应。

**细胞应对氧化RNA的机制**

APE1识别rAP位点；NGD途径通过DOM34和Cue2清除氧化mRNA；RNA结合蛋白AUF1、YB-1、PCBP1/2和细菌PNPase/RhlB选择性结合并降解氧化RNA；MutT同源物水解氧化NTPs防止其掺入核酸。

**结论**

RNA氧化损伤普遍存在且与多种病理相关。高通量测序技术（包括Illumina短读长测序和纳米孔长读长测序）的快速发展将推动RNA氧化研究取得更大进展。