《RSC Advances》：Discovery of new diaminoquinazolines against Mycobacterium tuberculosis: chemical synthesis and in vitro evaluationOpen Access
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尽管已有多种治疗方案，耐药性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）菌株的出现仍在全球范围内构成重大健康威胁，因此亟需开发具有独特作用机制的新型抗结核药物。二氨基喹唑啉（diaminoquinazolines, DAQs）
尽管已有多种治疗方案，耐药性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）菌株的出现仍在全球范围内构成重大健康威胁，因此亟需开发具有独特作用机制的新型抗结核药物。二氨基喹唑啉（diaminoquinazolines, DAQs）已显示出抗菌和抗寄生虫潜力，但其针对Mtb的探索仍不充分。为扩展DAQ的构效关系（structure–activity relationship, SAR）研究，研究人员合成了多种具有新颖C2/C4胺组合及核心结构修饰的多样化衍生物，并评估了其抗Mtb活性。SAR分析确定，C4位连接1-苄基哌啶-4-胺、C2位连接4-苯氧基苯胺为最优组合，由此获得的类似物14c和14f–14k对野生型和耐多药（multidrug-resistant, MDR）Mtb菌株均表现出强效活性。这些类似物对携带mmpL3、hadC和katG基因突变的牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis BCG）菌株同样具有活性，表明上述靶点并未参与DAQs的作用机制。因此，这些DAQ类似物为设计针对耐药结核病的新型分子提供了有前景的先导化合物。
**抗结核新药发现背景下二氨基喹唑啉衍生物的合成与体外活性研究——论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
结核病（tuberculosis, TB）是由空气传播的病原体——结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的慢性传染病，主要累及肺部，也可表现为肺外疾病。尽管世界卫生组织（World Health Organization, WHO）于1997年推出了直接面视下短程化疗（Directly Observed Treatment, Short-course, DOTS）策略，但该策略对全球结核病负担的降低作用有限。标准DOTS方案包含异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇，然而耐药Mtb菌株的出现严重削弱了该方案的临床疗效。新近获批的药物如贝达喹啉（bedaquiline）、德拉马尼（delamanid）、普托马尼（pretomanid）和利奈唑胺（linezolid）虽初显成效，但耐药性的演变以及QT间期延长、肾毒性、肝毒性和胃肠道并发症等不良反应限制了其长期应用。因此，开发具有新作用机制、更高疗效和更好安全性的新型抗结核药物迫在眉睫。
取代喹唑啉及其相关杂环化合物已被广泛报道具有抗菌和抗寄生虫活性。其中，2,4-二氨基喹唑啉类化合物（diaminoquinazoline, DAQ）通过干扰叶酸生物合成抑制Mtb生长；2-硫代-4-氨基喹唑啉衍生物则靶向Mtb的细胞色素bc1复合物。高通量表型筛选曾将DAQ确定为有希望的抗结核先导化合物，但先前的构效关系（structure–activity relationship, SAR）研究多局限于哌啶基C2取代和苄胺类C4取代，其他位置取代基的探索也仅限于匹配的C2/C4组合。鉴于C2/C4取代基组合和核心环修饰仍有广阔的探索空间，研究人员系统开展了新型DAQ衍生物的合成和抗Mtb活性评价。
**二、研究内容与结论概述**
本研究论文发表在《RSC Advances》上，研究人员设计并合成了50余个新型DAQ结构类似物，系统考察了此前未被探索的C2/C4取代基组合和核心结构修饰对抗Mtb活性的影响。研究首先评价了含伯氨喹（primaquine）侧链的DAQ杂合体（7a–7h）的活性，随后重点探索了C4位1-苄基哌啶-4-胺与多种C2胺的组合（系列14），并评估了C4位吲哚乙胺类衍生物（系列9a、10a–10e、12a、12b）以及吡唑并[3,4-d]嘧啶生物电子等排体（27a–27i）的活性。通过全细胞筛选确定了最优取代基组合，并对活性化合物进行了耐药菌株测试、作用机制初步探索和ADMET性质预测。SAR分析揭示，C4位1-苄基哌啶-4-胺与C2位4-苯氧基苯胺为最优组合，所得类似物14c和14f–14k对野生型和耐多药（multidrug-resistant, MDR）Mtb菌株均表现出强效活性（最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为3.12–4.42 μM）。这些类似物对携带mmpL3、hadC和katG突变的牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis BCG）菌株仍保持活性，表明其作用机制不涉及上述靶点。ADMET预测表明先导化合物脂溶性较高、水溶性较差，且存在hERG通道抑制风险。本研究扩展了DAQ衍生物的化学空间，为抗耐药结核病药物设计提供了重要的先导化合物和SAR数据。
**三、关键技术与方法**
研究人员采用了以下主要关键技术方法：（1）利用2,4-二氯喹唑啉等通用中间体，通过连续的亲核芳香取代（nucleophilic aromatic substitution, ArSN）反应构建多样化的C2/C4二取代喹唑啉二胺库，涉及不同胺的逐步引入；（2）采用微量肉汤稀释法测定化合物对Mtb H37Rv野生型菌株、MDR临床分离株（NR48748）以及M. bovis BCG野生型和单基因突变株（mmpL3 V643N、katG I335N、hadC T123A）的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）；（3）利用ADMETlab3.0在线平台预测先导化合物的理化性质和吸收、分布、代谢、排泄、毒性（ADMET）属性；（4）使用SMARTCyp网络工具预测化合物CYP3A4和CYP2D6介导的代谢位点。所有合成化合物均经核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行结构表征和纯度分析（纯度>95%）。
**四、研究结果**
**4.1 化学合成**
所有目标化合物均以喹唑啉构建单元为原料，采用已建立的合成方法制备。2,4-二氯喹唑啉（8）首先在1,4-二氧六环中于25–30 °C与C4胺反应2小时，得到4-取代喹唑啉中间体9a–9g；随后在异丙醇和三氟乙酸存在下回流8小时，进行第二次ArSN反应在C2位引入第二个胺，得到目标产物10a–10m和化合物6。以1-苄基哌啶-4-胺为C4胺的系列（13a–13f）通过类似方法合成，随后引入不同C2胺得到14a–14n。目标化合物22经Boc脱保护和哌啶氮上的亲核取代反应合成。吡唑并[3,4-d]嘧啶类似物（27a–27i）由4,6-二氯-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶经连续ArSN反应制得。所有化合物均经光谱技术表征，纯度经RP-HPLC分析确认。
**4.2 体外Mtb（H37Rv菌株）生长抑制与SAR研究**
首先评价了含伯氨喹侧链的DAQ杂合体（7a–7h）的活性，其MIC范围为6.25–12.5 μM，与此前报道的DAQ（如化合物6）相当。这些化合物与先前报道类似物的主要SAR差异在于：7a–7h通过较长连接链在C4位连接了大体积芳香胺（喹啉），而先前活性最强的类似物C4位为较小的苄基环。
C4位含吲哚乙胺的系列化合物（9a, 10a–10e, 12a, 12b）大多无活性，仅10b–10e表现出25 μM的中等活性。改变C4胺（10f–10h）未改善活性。化合物10i（化合物6的6,7-二甲氧基类似物）的MIC高于化合物6。将C2哌啶基替换为3,5-二甲基哌啶基（10j）或4-苯氧基苯胺（10k）导致活性完全丧失。互换化合物6的C2和C4取代基得到10l，活性大幅降低；而互换10k的C2/C4取代得到10m（MIC = 25 μM），活性有所改善。这些结果证实了胺在喹唑啉环上的位置对抗结核效力至关重要。
C4位为1-苄基哌啶-4-胺的系列化合物（14a–14n）表现出良好至中等的抗Mtb活性。C2位为饱和二甲基哌啶基（14a）或取代苯胺（14b–14d）的类似物MIC为4.42–8.84 μM；C2位引入吲哚乙胺（14e）导致活性降低。该系列中活性最强的化合物为14f（C2位为4-苯氧基苯胺），MIC为3.12 μM。在4-苯氧基苯胺环上引入吸电子的氟取代基（14g）或给电子的甲氧基取代基（14h）对MIC影响不大。去除6-甲氧基（14i）或同时去除6,7-二甲氧基（14j），或将甲氧基替换为6-溴（14k），均未导致活性显著丧失。将甲氧基从7位移至8位（14l）则对活性产生不利影响。缺乏6,7-二甲氧基且C2位为苯基（15）或哌啶基（14m）的化合物活性较弱。在C4位1-苄基哌啶-4-胺的苯环上引入氟取代基（22）对MIC无明显影响。将DAQ核心替换为二氨基-氮杂喹唑啉核心（18）导致抗结核效力降低。将7位甲氧基替换为苄氧基（14n）对MIC影响轻微。互换C2和C4取代基（24）使活性减半。综上，C4位1-苄基哌啶-4-胺与C2位4-苯氧基苯胺的组合赋予的抗结核活性对喹唑啉环周围的化学修饰具有相对较好的耐受性。
吡唑并[3,4-d]嘧啶类似物（27a–27i）全部无抗分枝杆菌活性（MIC > 50 μM），即使模拟活性DAQ的C2/C4取代模式也完全失活。研究人员注意到这些类似物相对DAQ具有较低的计算脂溶性（c log P值），而脂溶性有利于小分子渗透Mtb富含脂质的蜡状细胞壁。该结果凸显了喹唑啉骨架的关键作用，以及足够脂溶性对于抗Mtb活性的必要性。
**4.3 对药物敏感和耐药分枝杆菌菌株的抗菌活性**
化合物6、14f和14j对药物敏感型Mtb H37Rv野生型菌株的MIC为3.12–4.42 μM，对MDR Mtb菌株的MIC为1.56–3.12 μM。MDR菌株对一线抗结核药物异烟肼和利福平耐药，但对贝达喹啉敏感（MIC = 0.78 μM）。上述结果表明，所合成化合物对药物敏感和耐药Mtb均能发挥相当的抗分枝杆菌活性，对MDR菌株甚至显示出更强的抑制效果。
**4.4 潜在作用机制探索**
为探究这类化合物是否作用于结核病药物的已知靶点，研究人员测定了化合物对野生型M. bovis BCG及携带膜转运蛋白MmpL3（V643N）、过氧化氢酶过氧化物酶KatG（I335N）、分枝菌酸合成蛋白HadC（T123A）突变的菌株的MIC。结果显示，化合物14f和14h对野生型和各突变株的MIC保持在3.12–12.5 μM范围内，未发生显著升高，表明其作用机制不依赖MmpL3、HadC或KatG通路，可能涉及其他替代靶点。
**4.5 ADMET预测**
利用ADMETlab3.0平台对先导化合物14c、14f和14j的理化性质和ADMET属性进行了预测。三者均具有较高的log P和log D7.4值，提示较高的脂溶性可能有利于细胞壁穿透。其可旋转键数（ROTBs）均小于10，拓扑极性表面积（TPSA）在60–80 ?2范围内，符合Veber关于生物膜渗透性的标准。三者预测水溶性（log S）为?5至?6.25，提示内在水溶性较差，符合亲脂性分子的预期特征。此外，ADMETlab3.0预测三者对hERG通道均具有高亲和力（约1），提示潜在的心脏安全性风险。在CYP450代谢方面，三者均被预测为常见细胞色素P450（CYP450）同工酶的底物：14c和14j对CYP1A2具有强底物亲和力（0.9–1），14f为弱亲和力（0.5–0.7）；三者对CYP3A4均表现出强底物亲和力；对CYP2D6，14c和14j为弱、14f为中等底物亲和力。SMARTCyp预测显示，CYP3A4介导的N-脱苄基是14f和14c最可能的代谢途径，其次为哌啶环内的N-脱烷基化；CYP2D6介导的代谢对14f主要为芳香羟基化，对14c主要为O-脱烷基化。
**五、总结与讨论**
研究人员合成了超过50个新型DAQ结构类似物并评价了其抗Mtb活性。含伯氨喹侧链的类似物（7a–7h）表现出与先前DAQ相当的抗Mtb效力；多个C4-1-苄基哌啶-4-胺/C2-4-苯氧基苯胺系列化合物（14a–14n）的活性优于参考化合物6（C4-苄胺/C2-哌啶-1-基）。C4-吲哚乙胺类化合物（9a, 10a–10e, 12a, 12b）大多无活性；吡唑并[3,4-d]嘧啶生物电子等排体（27a–27i）全部失活，可能因脂溶性不足而无法有效渗透Mtb细胞壁。对MDR Mtb菌株和M. bovis BCG的mmpL3/hadC/katG突变株的表型分析证实，这类化合物的作用靶点独立于上述已知通路。ADMET计算表明，先导化合物的主要缺陷包括水溶性差和hERG通道抑制作用，有待后续实验验证。
**研究结论**：综上所述，研究人员报道了50余个新型DAQ结构类似物对Mtb的合成与体外评价。设计策略系统探索了此前未报道的C2/C4取代基组合和核心修饰。含伯氨喹的类似物7a–7h表现出与先前DAQ相当的抗Mtb效力，而多个C4-1-苄基哌啶-4-胺与C2-4-苯氧基苯胺组合的类似物（14a–14n）优于参考化合物6（C4-苄胺/C2-哌啶-1-基）。相比之下，C4-吲哚乙胺类（9a、10a–10e和12a、12b）大多无活性，吡唑并[3,4-d]嘧啶生物电子等排体（27a–27i）失败，可能由于其脂溶性不足以穿透Mtb细胞壁。针对MDR Mtb菌株以及M. bovis BCG的mmpL3/hadC/katG突变株的表型分析证实，其作用靶点独立于这些已知通路。这些发现扩展了用于结核病药物发现的DAQ衍生物化学空间，并突出了未来开发中取代基和核心骨架优化的关键机会。基于ADMET计算，先导化合物的主要缺陷包括水溶性低和hERG通道抑制，仍有待实验验证。
