OsCPK12-OsATPD1模块调控水稻对光胁迫的光合驯化

《Advanced Science》：OsCPK12-OsATPD1 Module Regulates Photosynthetic Acclimation to Light Stress in Rice

　　

光反应与暗反应之间的协同作用是光合作用的关键。这种协同作用不仅帮助植物实现最大光合效率，还在光合保护中发挥关键作用。然而，植物调控该过程的机制仍不清楚。本研究中，研究人员证明了钙依赖性蛋白激酶OsCPK12对于介导水稻对光强度的响应至关重要。oscpk12-cr突变体表现出光敏感的早衰。具体而言，光诱导的OsCPK12表达靶向ATP合酶亚基OsAtpD1叶绿体转运肽上的Ser8，从而促进其转运进入叶绿体。在oscpk12-cr中过表达OsAtpD1S8D可挽救其早衰表型。在oscpk12-cr、oscpk12-cr/OE-OsAtpD1S8A和RNAi-OsAtpD1植株中，ATP酶活性和电子传递速率（ETR）均降低。相反，水稻中OsCPK12过表达比ZH8015表现出更高的ATP酶活性和ETR。总之，OsCPK12磷酸化OsAtpD1以促进其叶绿体转位，从而维持ATP合酶活性和质子梯度（ΔpH）稳态，并调控光胁迫下的光合驯化、光保护和修复。研究结果揭示了OsCPK12-OsATPD1模块调控ATP合酶活性和ETR效率的内在机制，微调光合驯化以防止光损伤。

光合作用是光反应与暗反应高度协同的过程，这种协同既决定光合效率，也构成光保护的生理基础。然而，植物如何从分子层面协调光反应与暗反应以适应光胁迫，一直缺乏清晰的机制解释。钙依赖性蛋白激酶（CPK）在植物逆境信号转导中具有重要功能，但特定CPK成员如何参与光合调控尚不明确。研究人员此前发现水稻OsCPK12过表达可提高净光合速率和叶绿素含量，但其生化机制未知。基于此，该研究以水稻品种ZH8015及其oscpk12-cr突变体为材料，系统解析了OsCPK12调控光合驯化的分子途径。研究发现OsCPK12直接磷酸化ATP合酶δ亚基OsAtpD1叶绿体转运肽上的Ser8残基，促进OsAtpD1向叶绿体转运，从而维持ATP合酶活性和跨膜质子梯度（ΔpH）稳态，协调光合电子传递与碳同化，增强水稻对高光及波动光的适应能力。论文发表在《Advanced Science》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、荧光素酶互补成像（LCI）和双分子荧光互补（BiFC）验证蛋白互作；通过体外磷酸化实验结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定磷酸化位点；利用点突变和磷酸化模拟突变体分析Ser8功能；采用亚细胞定位和蛋白免疫印迹检测OsAtpD1的叶绿体转位效率；构建过表达、RNAi和CRISPR/Cas9敲除株系进行遗传功能验证；使用PAM荧光仪和电致变色位移（ECS）技术测定质子动力势（PMF）、质子传导率（gH+）、电子传递速率（ETR）和非光化学淬灭（NPQ）等光合参数。样本包括水稻ZH8015、oscpk12-cr、OsCPK12-OE、RNAi-OsAtpD1、osatpd1-cr及多种转基因互补材料。

研究结果如下：

2.1 OsCPK12可能参与调控水稻对光胁迫的光合驯化。通过对比不同光强下野生型与oscpk12-cr的表型，发现突变体在自然光和高光下表现出早衰，叶绿素含量、净光合速率（Pn）、PSII最大光化学效率（Fv/Fm）、PSII和PSI电子传递速率显著降低，而NPQ、过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量升高，D1蛋白降解加速，表明OsCPK12缺失导致光胁迫下光保护与修复能力受损。

2.2 OsCPK12与OsAtpD1互作并磷酸化其Ser8。Y2H、Co-IP、LCI和BiFC实验证实OsCPK12与ATP合酶δ亚基OsAtpD1特异互作。体外磷酸化实验证明OsCPK12可磷酸化OsAtpD1，LC-MS/MS鉴定出包括Ser8在内的多个潜在位点。通过定点突变和Phos-Tag凝胶电泳，确认Ser8是OsCPK12介导的主要磷酸化位点，并利用pSer8特异性抗体进一步验证了该位点在体内发生磷酸化。

2.3 OsAtpD1在Ser8的磷酸化状态促进其叶绿体转位。亚细胞定位显示，OsAtpD1-GFP在野生型原生质体中定位于叶绿体，而在oscpk12-cr中主要滞留于细胞质。磷酸化模拟突变OsAtpD1S8D在突变体背景中恢复叶绿体定位，而非磷酸化突变OsAtpD1S8A在野生型中则导致细胞质定位。蛋白免疫印迹分析显示，野生型中OsAtpD1以成熟形式为主，而突变体中前体形式积累，S8D可促进前体加工。这说明Ser8磷酸化对OsAtpD1的叶绿体导入至关重要。

2.4 OsAtpD1在Ser8的磷酸化状态是正常光合作用所必需。在oscpk12-cr中过表达OsAtpD1S8D可部分恢复叶绿素含量、Pn和早衰表型，而过表达S8A无恢复效果。敲除OsAtpD1导致幼苗致死，RNAi-OsAtpD1株系则表现类似oscpk12-cr的黄化和光合下降。ECS测量显示，功能缺失株系的PMF和ΔpH升高，gH+降至野生型的30%–40%，导致类囊体腔过度酸化，进而引起NPQ升高、ETR降低、PSI受体侧限制（Y(NA)）增加，表明Ser8磷酸化通过维持质子梯度稳态保障线性电子传递。

2.5 光诱导OsCPK12积累促进OsAtpD1叶绿体转位，从而提高光合速率。昼夜节律分析显示，OsCPK12和OsAtpD1转录及蛋白水平随光照增强而上升，野生型叶绿体中OsAtpD1丰度在午间达到峰值，而突变体显著偏低。叶片F1F0-ATP合酶活性在野生型中呈现上午和下午高、中午低的日变化模式，而突变体各时段均低于野生型。结果表明光信号通过诱导OsCPK12磷酸化OsAtpD1，促进其进入叶绿体参与ATP合酶组装，从而支持光合速率提升和光胁迫适应。

讨论部分总结：OsCPK12介导的OsAtpD1磷酸化是调控水稻光合驯化的关键节点。该磷酸化促进OsAtpD1向叶绿体转运，维持ATP合酶活性和ΔpH稳态，避免类囊体腔过度酸化，从而协调光反应与暗反应，优化电子传递并减少光损伤。同时，OsCPK12还可能通过磷酸化过氧化氢酶OsCATA和OsCATC协同增强抗氧化能力。对照实验表明，完全敲除OsAtpD1导致幼苗致死，而oscpk12-cr仅部分削弱OsAtpD1导入，说明OsAtpD1本身具有独立于磷酸化的必需功能。研究结论指出：OsCPK12-OsAtpD1模块通过调控ATP合酶活性和ETR效率，微调光合驯化以防止光破坏，为培育耐光胁迫水稻品种提供了新策略。