《Advanced Science》：Dual pKa Lipid Nanoparticles for Lung-tropic mRNA Delivery and pH-Programmed Endosomal Escape
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脂质纳米颗粒（LNPs）已使RNA疗法（包括获批的mRNA疫苗和siRNA药物）的临床应用成为可能。然而，全身给药后其在肝脏中的主要蓄积以及低效的内体逃逸仍是实现有效胞质递送和基因表达的关键瓶颈。在此，研究人员介绍了一种具有双pKa特性的合成可电离脂质，该特性
脂质纳米颗粒（LNPs）已使RNA疗法（包括获批的mRNA疫苗和siRNA药物）的临床应用成为可能。然而，全身给药后其在肝脏中的主要蓄积以及低效的内体逃逸仍是实现有效胞质递送和基因表达的关键瓶颈。在此，研究人员介绍了一种具有双pKa特性的合成可电离脂质，该特性在配制的LNPs中得以保留。研究人员表明，静脉注射后，这些双pKa LNPs产生肺选择性mRNA表达，其效能高于富含阳离子脂质的对照制剂，同时保持良好的耐受性。利用分子动力学模拟，研究人员发现质子化状态可支持可电离脂质与内体膜之间的两种不同相互作用模式，从而为高效内体逃逸提供了机制基础。此外，该制剂在急性肺部炎症模型中维持了稳健的肺表达并产生了治疗获益。这些结果在本文所研究的基于可电离脂质的LNPs中建立了结构-性质关系，并将双表观pKa行为确定为一种有望实现强效且耐受性良好的肺靶向RNA递送的特征。
论文解读：双pKa脂质纳米颗粒实现肺靶向mRNA递送与pH程序化内体逃逸
**研究背景与问题**
信使RNA（mRNA）脂质纳米颗粒（LNPs）已通过COVID-19疫苗产生重大临床影响，并正迅速扩展至系统性基因治疗领域。然而，常规LNPs在静脉给药后主要蓄积于肝脏，严重限制了肝外组织（尤其是肺）的治疗应用。肺急性损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等疾病存在大量未满足的临床需求，但目前的治疗手段多为支持性护理。选择性器官靶向（SORT）策略通过掺入永久阳离子脂质（如DOTAP）实现肺嗜性，但这些永久带电组分常加剧剂量限制性细胞毒性，导致递送效率与安全性之间难以兼顾。此外，低效的内体逃逸是mRNA递送的另一个主要瓶颈，现有pH响应设计往往依赖单一pKa转变，在内涵体成熟过程中电荷变化窗口有限。因此，开发能够在内涵体pH范围内逐步改变电荷状态、同时保持良好耐受性的可电离脂质，是推进肺靶向mRNA治疗的关键。
**研究内容与结论**
研究人员合成了一系列SG系列可电离脂质（SG2–SG6），通过辅助脂质筛选和两轮Taguchi正交阵列优化，确定了以SG5为基础的最终优化配方（fSG5）。该配方表现出两个可分离的表观pKa转变，与常规单pKa脂质不同。在体内外模型中，fSG5较经典的C12-200/DOTAP肺嗜性SORT体系（C12D）产生更强的肺选择性mRNA表达，且在急性肺损伤模型中递送Nrf2 mRNA显示出治疗获益。机理研究表明，双pKa行为源于SG5头基中两个紧密排列的胺基之间的电子耦合，使质子化沿内体pH梯度分步发生，从而促进pH依赖的膜扰动和内体逃逸。分子动力学模拟揭示了不同质子化状态对应的两种膜结合模式（膜插入和磷酸基锚定），为高效胞质释放提供了结构基础。该研究发表于《Advanced Science》。
**关键技术方法**
研究采用微波辅助环氧开环反应合成SG系列可电离脂质；通过TNS荧光和ζ电位滴定测定LNPs表观pKa；利用Taguchi正交数组系统筛选脂质比例；运用全原子分子动力学模拟分析LNP膜结构和内体膜插入行为；结合Laurdan膜流动性实验、pH依赖性溶血实验和共聚焦显微镜评估内体逃逸；使用CD-1小鼠、ROSA26报告小鼠及LPS诱导ALI模型进行体内功效和耐受性评价（样本均来源于商业供应商，如Oriental Bio、JAX等）。
**研究结果**
**2.1 SG系列可电离脂质的合成与辅助脂质筛选**
通过五种商品化环氧化物与N,N-二甲基乙二胺反应制备SG2–SG6。体外HeLa细胞和体内CD-1小鼠肺部的荧光素酶表达显示，SG5在SG系列中效率最高。分子对接和分子动力学模拟表明，DOPE作为辅助脂质时与SG5形成较弱的极性关联，有利于内体逃逸；而SG5的临界堆积参数（CPP
Rg）呈正偏差，可能与其高效递送相关。
**2.2 基于SG5的LNPs优化**
采用两轮Taguchi正交阵列（每轮9组）筛选脂质比例，结合体内外表达验证，最终确定2T7比例（fSG5）。与C12D相比，fSG5在体外转染效率相当，但在体内肺部的荧光素酶和Cre重组酶介导的tdTomato表达均显著更强，且不受总脂质/mRNA重量比的影响。
**2.3 fSG5的双转变表观pKa行为及类似物分析**
通过TNS和ζ电位滴定，fSG5显示两个表观pKa（TNS法：7.71和5.15）。SG5类似物分析表明，去除一个胺基（isoSG5）或延长胺间距（proSG5）均导致单pKa行为和脾脏趋向表达，证明双pKa依赖两个胺基的紧密排列和电子耦合。密度泛函理论计算进一步证实，质子化诱导的静电扰动可在SG5头基区域传播，而proSG5中因间距增大而衰减。
**2.4 pH依赖的膜性质与fSG5的内体逃逸**
Laurdan实验显示，fSG5在pH 5.5时膜界面堆积增加，而C12D无此变化，提示fSG5可在酸性条件下维持膜刚性。溶血实验表明，pHe 5.5时fSG5溶血率高达83.1%，远高于C12D的37.5%，说明其更强的内体膜破坏能力。共聚焦成像显示，fSG5与晚期内体/溶酶体标志物LAMP1的共定位（Pearson系数0.15）显著低于C12D（0.51），证实其mRNA能更高效地逃逸内体。
**2.5 质子化依赖的膜结合的分子动力学分析**
在模拟内体膜（含BMP/DOPE/DOPC）条件下，SG5的单质子化态（SMP）更倾向插入膜内部，而双质子化态（SDP）则通过静电作用与膜磷脂磷酸基形成高占有率（98.07%）的多点锚定。C12-200的两种状态均表现出较弱的磷酸基接近行为。该结果支持SG5通过pH依赖的膜插入和磷酸锚定两种模式协同促进内体逃逸。
**2.6 fSG5的体外细胞毒性与体内耐受性**
结晶紫染色和CCK-8实验表明，在最高剂量下fSG5的细胞存活率高于C12D。体内高剂量（1.0 mg/kg mRNA）下，fSG5处理组肺血管通透性（Evans Blue外渗）、血清ALT/AST水平与未处理组无显著差异，而C12D组显示血管渗漏和AST升高。组织学检查未见明显病变，重复给药未引起TNF-α、IL-6显著升高或肺组织MPO/iNOS诱导，表明fSG5具有良好的耐受性。
**2.7 fSG5在LPS诱导的ALI模型中的治疗效果**
在LPS诱导的ALI小鼠中，静脉注射Nrf2 mRNA负载的fSG5（0.3 mg/kg）显著降低肺水肿指数（0.80% vs 损伤组1.20%），改善大体形态和H&E组织学表现，减少Ly6G阳性中性粒细胞浸润。Western blot显示fSG5上调Nrf2下游抗氧化因子HO-1、GCLM和SOD2，其效果优于C12D，证明Nrf2 mRNA递送激活了细胞保护通路并缓解肺部炎症和损伤。
**讨论与结论**
讨论部分指出，fSG5的双pKa特性使其能在血液循环中保持近中性，在内体成熟过程中逐步增加阳离子电荷，从而扩大与内体膜相互作用的时间窗口并促进胞质释放。分子动力学揭示的两种膜结合模式进一步解释了其高递送效率。与含永久阳离子脂质的C12D相比，SG5的可滴定叔胺头基可能有助于降低毒性。研究尚需进一步探索蛋白冠组成、代谢清除和更广泛模型中的安全性与有效性。结论部分强调：研究人员证明了具有双转变表观pKa行为的可电离脂质及其LNP能够驱动强效的肺选择性mRNA表达，并在疾病相关模型中展现治疗潜力；这种逐步质子化的设计为pH程序化器官靶向和内体逃逸提供了新型结构-性质关系，为开发兼具高效与耐受性的肺靶向RNA递送系统奠定了基础。
