《Advanced Science》：Seeing the Chemistry of Biomolecular Condensates: In Situ Mapping of Composition and Water Content
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生物分子凝聚体是通过蛋白质与核酸的液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）形成的无膜细胞器。其功能角色与黏度和疏水性等材料性质紧密相关，这些性质是细胞状态的关键标志物。然而，传统上测定凝聚体的组成和含水量依赖于侵
生物分子凝聚体是通过蛋白质与核酸的液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）形成的无膜细胞器。其功能角色与黏度和疏水性等材料性质紧密相关，这些性质是细胞状态的关键标志物。然而，传统上测定凝聚体的组成和含水量依赖于侵入性操作，这些操作会改变其热力学状态或可能损伤样品。在此，研究人员引入了拉曼光谱（Raman spectroscopy）结合光谱相量分析（spectral phasor analysis），作为一种原位、无标记的方法，用于估算生物分子凝聚体的致密相和稀相中的化学谱图及相对分子贡献。该方法优于传统的回归和解卷积方法，能够估算客体分子（client molecule）的分配。通过考虑蛋白质主链对凝聚体拉曼光谱的贡献，研究人员评估了来自蛋白质水化的“类固态”（“solid-like”）氢键结合水的特征，揭示凝聚体内大多数水分子保持主体“类液态”（“liquid-like”）特性。最后，利用环境敏感荧光探针，研究人员证明大分子结构和含水量——而非单独的氢键——驱动凝聚体的疏水性；值得注意的是，即使表观介电常数较低，致密相仍以水为主。
生物分子凝聚体是通过液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）形成的无膜细胞器，其功能与黏度、疏水性等材料性质密切相关。传统测定凝聚体组成和含水量的方法常需干燥、离心等侵入性步骤，可能改变其天然相行为或损伤样品。针对这一问题，研究人员在《Advanced Science》发表研究，提出拉曼光谱（Raman spectroscopy）与光谱相量分析（spectral phasor analysis）相结合的原位、无标记方法，以定量解析凝聚体致密相与稀相的化学组成和水分含量。
研究背景方面，凝聚体的材料性质被认为是其生物学状态的重要标志，而水在细胞组织和生化活性中具有双重作用。然而，凝聚体内受限水与类主体水的体积分数此前缺乏直接的实验测定；染料报告的“疏水性”是否直接反映致密相中的实际水分数也尚不明确。已有拉曼光谱分析方法多依赖经验指标或回归、拟合手段，易受谱峰重叠、Fermi共振及蛋白质主链自身O–H/N–H振动贡献的干扰。研究人员通过光谱相量分析利用傅里叶空间中光谱混合的线性几何性质，无需预设拟合模型或大量校准数据集，即可直接估算凝聚体内聚合物、水及小分子的相对体积分数。
研究人员首先以聚乙二醇（PEG）-水体系为基准，证明相量分析能从集成拉曼强度中准确推算聚合物体积分数，并优于多元曲线分辨-交替最小二乘（MCR-ALS）、主成分回归（PCR）和偏最小二乘回归（PLSR）。随后在聚乙二醇-葡聚糖双水相体系（ATPS）中验证了该方法对相分离系统组成定量的可靠性。针对单液滴凝聚体，研究人员分析了R10-D10多肽凝聚体，发现致密相中约41%为R10、59%为D10，且只有在液滴半径大于约10–15 μm时才能获得与尺寸无关的固有组成读数。ATP分配实验显示，ATP可优先取代D10，在25 mm ATP时ATP分子分数接近40%。高光谱拉曼成像进一步实现了像素级组成分布：glycinin凝聚体中蛋白质与水呈二元混合行为，致密相约含23% glycinin和77%水；PEG-BSA体系则呈三元混合，显示出BSA在致密相富集、PEG在稀释相富集的趋势。基于环境敏感荧光探针ACDAN的介电常数测量表明，不同凝聚体系统呈现较宽的疏水性谱系；但Raman数据显示，致密相中由蛋白质水化产生的长寿命氢键结合水贡献可忽略，水主要以类主体水的形式存在。疏水性的强弱并非仅由含水量或氢键决定，而是水分配、蛋白质结构及局部水化动力学共同作用的结果；对于结构化蛋白质形成的凝聚体，即使含水量高于72%，仍可表现出极高的表观疏水性，这归因于探针在蛋白质富集的疏水微环境中局部富集以及蛋白质表面附近水动力学显著减缓。ACDAN浓度升高时表观介电常数升高的现象进一步支持该解释，同时Raman确认致密相并未变得更为水合。
讨论部分指出，该方法避免了分子标签对蛋白质拓扑和相互作用的干扰，为单凝聚体水平的组成学研究提供了微扰极小的工具。Raman-相量分析还可用于追踪凝聚体成熟或应激过程中的组成重塑、估计客户分子的分配系数，并在体内环境中区分蛋白质、核酸、脂质富集区域等宽泛组分类别。此前关于凝聚体中水结构变化的拉曼研究可能因未考虑液滴尺寸效应及蛋白质主链O–H/N–H的固有贡献而产生误导；一旦校正后，凝聚体内水的拉曼特征与主体液态水不可区分。研究还提出多尺度疏水组织模型：凝聚体中存在不同疏水性的微环境，结构化区域可局部富集疏水性小分子，而亲水性物种则保留在水富集区域。这种疏水对比可能影响界面张力、润湿行为及凝聚体-膜相互作用。结论是，拉曼显微术与环境敏感荧光成像的结合，为表征不同尺寸、结构和相分离机制形成的凝聚体提供了定量框架，有助于理解生物及生物工程系统中生物分子凝聚体的物理化学基础。
