丽沙病毒核蛋白诱导GPAT4介导的CYB5R1去棕榈酰化以抑制铁死亡并促进病毒复制

《Advanced Science》：Lyssavirus Nucleoprotein Induces GPAT4-Mediated CYB5R1 Depalmitoylation to Suppress Ferroptosis and Promote Viral Replication

　　

狂犬病病毒(RABV)及其他丽沙病毒(lyssaviruses)利用脂滴(LD)形成来逃避宿主防御，但潜在机制仍不清楚。研究人员证明丽沙病毒N蛋白通过上调甘油-3-磷酸酰基转移酶4(GPAT4)表达并促进其转位至LD表面来诱导LD生物合成，这是丽沙病毒属中保守的机制。机制上，GPAT4介导的LD形成隔离游离脂肪酸，导致酰基蛋白硫酯酶1(APT1)依赖的细胞色素b5还原酶1(CYB5R1)在Cys208和Cys278处去棕榈酰化。该翻译后修饰触发CYB5R1的自噬降解，从而通过其两条互补途径削弱其诱导铁死亡的能力：核受体共激活因子4(NCOA4)介导的铁蛋白自噬(ferritinophagy)和H2O2产生。反之，二酰甘油O-酰基转移酶(DGAT)抑制剂或GPAT4敲低可恢复CYB5R1棕榈酰化和稳定性，重建铁死亡，并抑制RABV感染。研究发现揭示了新型的“丽沙病毒N-GPAT4-LD-CYB5R1棕榈酰化”轴可调控铁死亡易感性，突出蛋白质棕榈酰化作为病毒-宿主互作中的关键调控节点，并鉴定GPAT4为潜在抗病毒靶点。

研究背景方面，丽沙病毒为嗜神经弹状病毒，可引起哺乳动物致死性脑炎；其基因组编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和聚合酶(L)，其中N蛋白是病毒复制与宿主适应的重要调节者。脂滴(LD)是储存中性脂质的动态细胞器，在中枢神经系统中参与脂质稳态；神经病毒可诱导LD形成以支持复制并抑制宿主防御。铁死亡是一种铁依赖、脂质过氧化驱动的细胞死亡途径，在某些病毒感染中作为抗病毒防御机制，但嗜神经丽沙病毒如何逃逸该途径尚不清楚。蛋白质S-棕榈酰化是可逆的半胱氨酸棕榈酸修饰，可调控蛋白定位、稳定性与功能；细胞色素b5还原酶1(CYB5R1)可通过产生H₂O₂参与铁死亡，但其翻译后修饰在丽沙病毒感染中的作用未知。因此，研究人员开展本研究以阐明病毒诱导LD形成经棕榈酰化调控铁死亡的分子机制。该论文发表在《Advanced Science》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用N2a细胞、人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞及原代神经元作为神经元模型；采用RNA测序鉴定差异基因，脂质组学分析甘油酯代谢中间体，酰基-生物素交换(ABE) assay检测CYB5R1棕榈酰化，共免疫沉淀(co-IP)分析NCOA4与铁蛋白重链(FTH)互作， confocal显微镜观察GPAT4与LD共定位，CRISPR/Cas9构建CYB5R1敲除细胞，siRNA/shRNA敲低GPAT3、GPAT4、APT1、NCOA4，并以DGAT抑制剂、APT1抑制剂ML348、自噬/蛋白酶体抑制剂处理验证通路。

研究结果方面，2.1 抑制甘油三酯生物合成通过上调CYB5R1抑制RABV感染：研究人员用DGAT抑制剂处理RABV感染的神经元模型，RNA-seq显示CYB5R1为最显著上调基因；DGAT抑制降低甘油三酯(TG)与PLIN2，恢复CYB5R1 mRNA和蛋白，并减少RABV-N蛋白，说明抑制LD形成经CYB5R1上调限制感染。2.2 CYB5R1通过在神经元细胞中抑制病毒复制限制RABV感染：过表达CYB5R1降低病毒滴度和RABV-N，敲除则增加滴度；附着/进入阶段基因组RNA无差异，而复制阶段RABV-N mRNA下降，表明CYB5R1主要抑制病毒复制。2.3 CYB5R1通过NCOA4介导铁蛋白自噬和H₂O₂产生调控铁死亡易感性限制RABV复制：CYB5R1过表达升高MDA、Fe²⁺、脂质过氧化与H₂O₂，增加LC3-II/I、NCOA4，降低FTH；氯喹阻断FTH溶酶体降解，去铁胺或N-乙酰半胱氨酸回补细胞死亡与病毒复制，说明CYB5R1经铁蛋白自噬和ROS两条途径增强铁死亡。2.4 RABV-N通过诱导LD形成促进APT1介导CYB5R1去棕榈酰化降低其稳定性：仅RABV-N显著降低CYB5R1蛋白；RABV-N升高TG、LD数并降低游离脂肪酸与棕榈酰-CoA；APT1抑制剂ML348而非APT2抑制剂ML349恢复CYB5R1稳定性与棕榈酰化，APT1敲低同理，表明RABV-N经LD使APT1在胞质积聚并去除CYB5R1棕榈酰。2.5 RABV-N通过降低Cys208和Cys278棕榈酰化诱导CYB5R1自噬降解以降低铁死亡易感性：位点突变显示C208S/C278S不能被ML348稳定；突变体不能恢复Fe²⁺积累与抗病毒限制；氯喹而非MG132 rescue降解，证明去棕榈酰CYB5R1经自噬-溶酶体途径降解。2.6 RABV-N诱导GPAT4表达并转位至LD表面促进LD形成与成熟：脂质组学见FA/MG/DG/TG积累；GPAT3与GPAT4上调，但GPAT4敲低才显著降TG、LPA、LD数目与直径；RABV-N增强GPAT4-mCherry在BODIPY阳性LD表面信号；GPAT4敲低恢复CYB5R1棕榈酰与稳定。2.7 丽沙病毒属N蛋白保守促进GPAT4介导LD形成：DRV、LBV、ABLV、DUVV的N蛋白均升TG、降FFA、上调GPAT4并促其LD表面转位，siGPAT4取消TG与LPA升高，说明该机制在丽沙病毒属保守。2.8 丽沙病毒属N蛋白通过GPAT4介导LD形成经APT1去棕榈酰化降低CYB5R1铁死亡易感性：各N蛋白降H₂O₂、升脂质过氧化与Fe²⁺于GPAT4敲低时显现；N蛋白降CYB5R1表达与棕榈酰，GPAT4敲低可逆转，而C208S+C278S突变体中DRV与LBV N不能改变CYB5R1稳定性。

讨论部分总结：病毒常经调控脂质代谢酶诱导LD；本研究首次表明丽沙病毒N蛋白上调GPAT4表达与转位，推动LPA与TG合成及LD生物合成，LD隔离游离脂肪酸使CYB5R1去棕榈酰而稳定性下降，抑制铁死亡。铁死亡在病毒感染中具有双向作用，而CYB5R1经NCOA4-铁蛋白自噬与H₂O₂途径调控易感性；棕榈酰化如GPX4、B7-H4、TIM-3般可决定蛋白稳定，本研究发现Cys208/Cys278为抗病毒“分子开关”。APT1而非APT2主导CYB5R1去棕榈酰，反映底物特异性；GPAT3敲低仅缩LD大小，GPAT4敲低消除LD形成，因神经元中GPAT4基线更高。该“N-GPAT4-LD-CYB5R1棕榈酰化-铁死亡”轴为丽沙病毒属保守适应，GPAT4/APT1抑制具广谱抗病毒潜力。

研究结论部分翻译：丽沙病毒核蛋白(N)上调GPAT4表达，从而增强三酰甘油(TG)生物合成与LD生物合成。该代谢重编程引发APT1介导的CYB5R1在Cys208与Cys278残基去棕榈酰化，促进其经自噬-溶酶体途径降解。同时，该轴抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬，从而减弱铁死亡易感性，并最终营造利于病毒复制的环境。