淋巴管生成受体VEGFR-3激活的结构基础：配体–受体复合物独特聚集所介导

《Advanced Science》：Structural Basis of Lymphangiogenic Receptor VEGFR-3 Activation Mediated by Distinctive Clustering of the Ligand–Receptor Complex

　　

血管内皮生长因子-C（VEGF-C）及其受体VEGFR-3对淋巴管生成至关重要，然而驱动激活的超越简单二聚化的结构机制仍不明确。研究人员报告了人VEGFR-3全胞外域（full ectodomain）与VEGF-C复合物的首个冷冻电镜（cryo-EM）结构。这种经典的配体诱导的2:2异源四聚体复合物进一步自组装成不同的高阶组装体——侧向顺式簇（cis-cluster）和倒置的类反式簇（trans-like-cluster）。研究人员对这些高阶组装体中的经典2:2异源四聚体的进一步分析发现，VEGF-C对VEGFR-3和VEGFR-2相对于VEGFR-1的特异性主要由其N端α₁螺旋决定，该螺旋在结构上被VEGFR-3和VEGFR-2的D₂结构域所容纳，但被VEGFR-1突出的D₁–D₂连接环空间排阻。此外，研究人员识别出一个位于膜近端D₅结构域内、发生在相邻经典2:2复合物之间的独特界面，该界面由特定的“WTP基序”介导，是顺式聚集的关键驱动因素。结构引导的诱变和实时光遗传学实验支持顺式聚集在信号放大中的关键作用，并表明强制的受体聚集可驱动强效激活，而类反式聚集似乎是可有可无的。总之，这些发现将VEGFR-3/VEGF-C传统的“单体-二聚体”激活模型转变为“二聚体-簇”范式，为设计靶向淋巴管疾病的下一代疗法提供了蓝图。

血管系统由相互连接的血液和淋巴管组成，对组织稳态、体液平衡和免疫监视至关重要。血管内皮生长因子-C（VEGF-C）及其受体VEGFR-3是淋巴管生成的关键调节因子，该通路失调可导致遗传性淋巴水肿或促进肿瘤相关淋巴管生成及转移。尽管VEGFR-3属于受体酪氨酸激酶（RTK）的V型亚家族，经典模型认为配体诱导的受体二聚化是激活开关，但近年来对其他RTK成员（如EGFR、Eph受体）的研究表明，高阶寡聚或聚集可放大或调节信号输出，而VEGF/VEGFR家族是否存在类似机制尚不清楚。此外，VEGFR-3全胞外域（ECD）与VEGF-C复合物的完整结构一直缺失，部分结构分辨率有限，阻碍了对激活机制的理解。为此，研究人员开展了本研究，成果发表在《Advanced Science》上。

研究人员利用Expi293F细胞共表达人VEGFR-3 ECD（D₁–D₇）和成熟VEGF-C（C137A突变），通过亲和纯化和尺寸排阻色谱（SEC）获得复合物。采用负染电镜和冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析解析了高分辨率结构，并通过SEC分析浓度依赖性寡聚。基于结构设计定点突变（cis-MUT、trans-like-MUT、combined MUT），在HEK293T细胞中表达全长VEGFR-3突变体，利用免疫印迹、荧光生物传感器活细胞成像及基于CRY2PHR的光遗传学系统评估信号转导。

2.1 人VEGFR-3/VEGF-C复合物高阶组装体的总体结构：通过cryo-EM观察，VEGF-C诱导形成经典的2:2异源四聚体，并进一步自组装为两种高阶组装体——侧向顺式簇和倒置类反式簇。SEC显示聚集行为呈浓度依赖性且可逆，排除了非特异聚集的可能。

2.2 二聚化VEGFR-3/VEGF-C复合物的构象与结构可塑性：原子模型显示VEGF-C通过D₂和D₃结构域结合VEGFR-3，D₅介导受体-受体同型二聚化。将顺式和类反式组装中的D₁–D₅二聚体比对发现，D₃–D₄铰链区可旋转约20°，赋予复合物适应不同聚集模式的构象可塑性。

2.3 VEGFR-2和VEGFR-3对VEGF-C结合模式的结构比较：与VEGFR-2/VEGF-C结构比对显示，VEGFR-2 D₂以更陡峭的角度（约15°）结合配体，并因M197和M213的位阻使VEGF-C α₁螺旋发生约7°旋转，界面堆积较松散，解释了VEGF-C对VEGFR-2