14-3-3蛋白维持中枢神经系统中脱髓鞘的小直径轴突

《GLIA》：The Maintenance of Dysmyelinated Small-Diameter Axons by 14-3-3s in the Central Nervous System

　　

中枢神经系统中，少突胶质细胞围绕神经轴突形成的髓鞘能够实现动作电位的高效传导并维持轴突稳态。因此，在脱髓鞘疾病如多发性硬化（MS）中，可观察到轴突变性与丢失，尤其多见于小直径轴突。Teneurin-4缺陷（Ten-4^-/-）小鼠表现出严重的小直径轴突脱髓鞘，但可存活超过一年。本研究旨在利用Ten-4^-/-小鼠阐明无髓鞘小直径轴突的存活机制。免疫组织化学分析显示神经丝出现异常弥散和强染色。此外，Ten-4^-/-小鼠中非磷酸化神经丝和淀粉样前体蛋白的免疫组织化学信号均较高。电子显微镜分析意外揭示，尽管缺乏致密髓鞘，Ten-4^-/-小鼠的小直径轴突在1岁龄时仍能存活。为阐明其分子机制，研究人员通过质谱法对Ten-4^-/-组织进行了蛋白质组学分析。结果表明，七个14-3-3亚型中有四个在Ten-4^-/-小直径轴突中高表达。最后，当使用14-3-3抑制剂BV02和difopein抑制Ten-4^-/-小鼠中14-3-3s的功能时，可观察到小直径轴突损伤的进展。总之，14-3-3s是脱髓鞘小直径轴突中的促存活因子之一。研究人员的发现可能有助于更好地理解MS等脱髓鞘疾病的发病机制，并有助于开发新的治疗方法。

论文解读：14-3-3蛋白维持中枢神经系统脱髓鞘小直径轴突的机制研究

一、研究背景与科学问题

在中枢神经系统（CNS）中，少突胶质细胞（OLs）形成髓鞘包裹神经轴突，髓鞘不仅实现动作电位的跳跃式传导，还通过供给单羧酸（如乳酸和丙酮酸）维持轴突稳态。多发性硬化（MS）是最典型的脱髓鞘疾病，患者常先出现复发-缓解病程，随后转入以慢性脱髓鞘导致轴突变性为特征的继发进展型病程，出现视力障碍、自主神经病变和肌无力等症状，但针对继发进展型缺乏有效治疗。轴突细胞骨架主要由微管（MTs）、神经丝（NFs）和肌动蛋白丝构成，髓鞘化轴突中这些细胞骨架排列有序；而脱髓鞘轴突则表现为NF去磷酸化导致的间距减小和NF碎裂。淀粉样前体蛋白（APP）是常用的轴突损伤/变性标志物，正常轴突中APP随轴突快速运输而难以被免疫组化检测，轴突损伤时因运输障碍导致APP积聚。在MS中，轴突变性与丢失主要发生在小直径轴突，典型位于脊髓皮质脊髓束（CST）和薄束（FG），但详细机制未明。

已有动物模型存在局限：shiverer小鼠因缺乏髓鞘碱性蛋白（MBP）导致严重髓鞘形成障碍，但寿命短（约100天），无法长期观察；蛋白脂蛋白（PLP）和2′,3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（CNP）敲除小鼠虽能形成髓鞘却出现轴突变性，不适合研究无髓鞘状态下的轴突维持。Teneurin-4（Ten-4）是II型跨膜蛋白，在OLs和神经元中均有表达，促进二者黏附。研究人员前期发现Ten-4缺陷（Ten-4^-/-）小鼠在CST和FG等小直径轴突区域存在显著脱髓鞘，但可存活超过一年，部分个体存活超过两年，为长期研究脱髓鞘小直径轴突提供了独特模型。本研究旨在利用Ten-4^-/-小鼠阐明无髓鞘小直径轴突维持和/或变性的分子机制。

二、主要技术方法

研究人员使用1岁龄Ten-4^-/-小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠，取脊髓背柱（DC）组织进行研究。主要技术方法包括：免疫组织化学染色检测NF、非磷酸化NF（SMI-32）、APP及胶质细胞标志物Iba1和GFAP；透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察轴突超微结构；鸟枪法质谱结合无标记定量蛋白质组学分析鉴定差异表达蛋白；Western blotting验证14-3-3蛋白表达；使用14-3-3化学抑制剂BV02腹腔注射，以及构建表达difopein（一种人工14-3-3抑制肽）的AAV-PHP.S载体经眶后静脉注射进行神经元特异性抑制实验。小鼠品系由美国NIDCR/NIH的Yoshihiko Yamada博士提供，动物实验经东京科学大学/东京医科齿科大学内部委员会批准。

三、研究结果

3.1 Ten-4^-/-小鼠小直径轴突区域出现轴突损伤或变性

对1岁龄小鼠脊髓DC进行免疫组化分析，发现Ten-4^-/-小鼠CST和FG区域（部分FC区域）NF呈强烈弥散性染色，且这些弥散染色的NF大多对SMI-32和APP呈阳性，提示脱髓鞘小直径轴突发生损伤。在7周龄（WT髓鞘化完成时期），Ten-4^-/-小鼠CST和FG中NF已呈弥散染色但程度较轻，SMI-32信号升高，APP阳性信号仅出现在CST。在出生后第7天（P7，髓鞘化起始前），WT与Ten-4^-/-小鼠之间NF、SMI-32和APP的染色无差异，表明轴突在髓鞘化开始前正常形成，损伤发生于髓鞘形成障碍之后。此外，1岁龄Ten-4^-/-小鼠CST和FG中Iba1阳性小胶质细胞活化（细胞数量增加、胞体增大、突起延伸）和GFAP阳性星形胶质细胞增生明显，而7周龄时无显著变化，胶质反应与轴突损伤标志物变化一致。

3.2 Ten-4^-/-小鼠脱髓鞘小直径轴突得以维持

电子显微镜分析1岁龄小鼠脊髓，确认Ten-4^-/-小鼠小直径轴突脱髓鞘，CST和FG中轴突密度增加。但令人意外的是，这些脱髓鞘小直径轴突并未消失，而是持续存在，NF点状信号较WT增多，推测为NF碎裂所致。典型变性形态（轴突肿胀、细胞器积聚）极少观察到。FG区域每个轴突的线粒体数量显著增加。在更老龄段（1岁7个月），脱髓鞘小直径轴突仍然维持。在7周龄时已观察到类似趋势。这些结果表明Ten-4^-/-小直径轴突虽有损伤标志物增加，但并未进入典型形态学变性阶段，长期存活，提示存在正向调控脱髓鞘小直径轴突维持的分子机制。

3.3 寻找维持小直径轴突的关键分子

对1岁龄小鼠DC组织进行鸟枪法质谱和label-free定量蛋白质组学分析，发现37个蛋白在WT与Ten-4^-/-间差异表达，其中6个下调蛋白均为OL特异性蛋白（如MBP、CNP、PLP1等），与Ten-4^-/-组织中OL显著减少一致。31个上调蛋白中包括大量NF和轴突细胞骨架蛋白（NF-M、NF-L、NF-H、α-中连蛋白、外周蛋白等），推测是轴突损伤导致蛋白降解碎片化从而增强可检测性。此外上调蛋白还富集于ATP合成通路（ATP合酶亚基、磷酸丙酮酸水合酶等），提示线粒体代谢和糖酵解在脱髓鞘轴突维持中增强，这与线粒体数量增加相符。进一步筛选上游调控蛋白时发现14-3-3蛋白家族多个亚型（β、γ、ε、ζ）在Ten-4^-/-组织中上调。14-3-3s是多功能调控蛋白，参与包括通过线粒体通透性抑制凋亡在内的多种细胞信号通路，因此后续研究聚焦于14-3-3s。

3.4 14-3-3s在Ten-4^-/-小鼠CST轴突中表达升高

Western blotting证实1岁龄Ten-4^-/-DC组织中14-3-3s表达上调。免疫组化显示Ten-4^-/-小鼠CST中14-3-3s表达升高，且与弥散或点状的NF染色明显重叠，表明14-3-3s在脱髓鞘小直径轴突内上调。升高的14-3-3s信号与Iba1（小胶质细胞）和GFAP（星形胶质细胞）几乎不重叠，WT中胶质细胞仅有弱表达。

3.5 抑制14-3-3s促进轴突损伤进展

使用14-3-3化学抑制剂BV02对Ten-4^-/-小鼠连续腹腔注射7天。免疫组化显示BV02处理后CST中APP信号显著增加，SMI-32无统计学差异。超微结构定量分析显示BV02处理的轴突中MTs和线粒体面积显著减少，而MTs和线粒体的减少正是轴突损伤晚期阶段的特征。为进一步验证，研究人员使用神经元特异性synapsin-1启动子驱动difopein表达，并通过可穿越血脑屏障的AAV-PHP.S载体经静脉注射感染脊髓。感染3周后，difopein表达组CST的SMI-32和APP信号均显著高于对照组，且轴突内MTs和线粒体面积百分比显著降低。两种抑制实验均表明阻断14-3-3s功能会促进脱髓鞘小直径轴突的损伤进展，证实14-3-3s是脱髓鞘小直径轴突的促存活因子。

四、讨论与结论

本研究利用Ten-4^-/-小鼠模型（该模型OL髓鞘形成广泛受抑但寿命超过一年，且脱髓鞘特异性发生于MS中最易受损的小直径轴突区域），发现脱髓鞘小直径轴突虽呈现损伤早期特征（NF去磷酸化、碎裂、APP积聚、胶质反应），但通过增强线粒体代谢和上调14-3-3s表达而阻滞于损伤晚期之前，实现长期存活。抑制14-3-3s后，轴突进入晚期变性（MTs和线粒体减少），证明14-3-3s是关键的促存活因子。

14-3-3s通过与磷酸化客户蛋白（如Bad、Bax、Bim）结合发挥抗凋亡作用；当这些蛋白去磷酸化后进入线粒体释放细胞色素c，抑制电子传递链，触发凋亡。因此Ten-4^-/-轴突中高表达的14-3-3s可能通过抗凋亡信号维持轴突存活。值得注意的是，Fusicoccin-A（FC-A）能稳定14-3-3与客户蛋白结合并促进轴突再生，可能对脱髓鞘疾病中的轴突存活有潜在疗效。此外，MS患者脑脊液中14-3-3蛋白水平升高，可能反映了脱髓鞘轴突的损伤反馈；近期研究也提示脱髓鞘轴突比髓鞘化轴突对变性更具耐受性，这可能与去除功能障碍髓鞘后轴突能利用细胞外代谢物以及促存活因子（如14-3-3s）的活性有关。

关于小直径轴突的特异性易损性，可能与长轴突远端距离胞体较远以及少突胶质细胞亚群功能差异有关——Ten-4^-/-脊髓中优先髓鞘化小直径轴突的I型/II型OL分化受阻。本研究的结论是：在Ten-4^-/-小鼠中，小直径轴突在脱髓鞘后受损但得以维持，这种存活由14-3-3s正向调控。该发现有助于理解轴突维持的正常和病理机制，并为开发抑制MS等髓鞘相关疾病进展或改善症状的治疗药物提供新思路。论文发表于《GLIA》。