蟾蜍灵通过AKT信号通路抑制黑色素瘤进展及内皮血管生成表型

《Cancer Reports》：Bufalin Inhibits Melanoma Progression and Endothelial Angiogenic Phenotypes via AKT Signaling

　　

摘要

引言：蟾蜍灵（BF）在多种肿瘤类型中展现出抗肿瘤活性。然而，关于BF在黑色素瘤中的研究报道较少，其药理作用尚未阐明。本研究旨在探讨BF对黑色素瘤及血管生成的影响，并探索其可能机制。

方法：采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和集落形成实验评估黑色素瘤细胞活力。使用流式细胞术评估细胞周期和凋亡。通过划痕实验和Transwell小室迁移实验检测细胞迁移与侵袭。运用生物信息学分析和分子对接预测BF的潜在靶点。采用蛋白质印迹法检测相关蛋白表达。为评估蟾蜍灵体内抗肿瘤活性，使用A375肿瘤细胞建立皮下异种移植模型。

结果：BF对黑色素瘤细胞生长具有抑制作用，并使细胞周期阻滞于G2/M期。Annexin V-FITC/PI染色实验表明BF可促进细胞凋亡。BF还能抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长、迁移和管状结构形成。生物信息学分析提示，BF对黑色素瘤的抑制作用可能由PI3K-AKT信号通路调控。分子对接结果显示，BF与AKT1形成氢键。蛋白质印迹分析表明，BF抑制磷酸化AKT（p-AKT）蛋白水平。蟾蜍灵可抑制异种移植小鼠模型中的黑色素瘤肿瘤生长。

结论：研究结果表明，BF在体外和体内均发挥抗肿瘤活性。分子对接和蛋白质印迹分析显示，BF通过下调p-AKT的表达发挥抗肿瘤作用。

恶性黑色素瘤是一种来源于黑素细胞的严重皮肤癌，其发病率与死亡率逐年上升。晚期黑色素瘤对放化疗不敏感，5年生存率仅为32%–52%。在多达70%的黑色素瘤病例中存在PI3K/AKT通路改变，且与疾病进展密切相关。PI3K/AKT通路是内皮细胞多种关键功能所必需的，包括细胞生长、迁移、存活和血管张力调控。AKT1通过磷酸化并调控下游效应因子而促进黑色素瘤脑转移和血管生成。蟾蜍灵（BF）是来源于蟾酥（Chan Su）的强心苷类化合物，属于传统中药，已被用于治疗肿瘤复发和转移，并可减轻放化疗副作用、改善临床疗效和生活质量。尽管BF在多种实体瘤中具有抗肿瘤作用，但在黑色素瘤中的研究报道较少，其药理效应尚未阐明。已有研究大多聚焦于caspase和线粒体途径诱导凋亡，或识别单一结合靶点，尚无研究系统探讨BF是否通过p-AKT作为汇聚节点协调凋亡和细胞周期阻滞。此外，AKT在BRAF突变型和BRAF野生型黑色素瘤中均频繁激活，既往报道未明确BF的抗黑色素瘤效应是否独立于BRAF背景。本研究首次证明，BF可降低两种BRAF突变黑色素瘤细胞系（A375和A2058）中p-AKT蛋白水平，且该降低与凋亡增加和G2/M期阻滞机制相关。由于p-AKT是细胞死亡和细胞周期进程公认的关键调控因子，该发现提供了新的概念框架：BF作为AKT磷酸化的上游抑制剂，单一事件即可协调下游抗肿瘤程序。该研究旨在探讨BF对黑色素瘤及血管生成的影响，并验证其通过AKT信号发挥作用的假说。研究人员以A375和A2058黑色素瘤细胞及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为对象，结合体外功能实验、网络药理学、分子对接、蛋白质印迹和裸鼠异种移植模型，发现BF能以剂量和时间依赖方式抑制黑色素瘤细胞生长，诱导凋亡并阻滞细胞周期于G2/M期，同时抑制黑色素瘤细胞迁移、侵袭及HUVEC的增殖、迁移和管状结构形成。生物信息学分析提示PI3K-AKT通路为关键通路，分子对接显示BF与AKT1在ASN 53位形成氢键，蛋白质印迹证实BF降低p-AKT水平而不影响总AKT和PI3K，SC-79救援实验进一步验证了靶向性。体内实验显示BF显著抑制A375移植瘤生长，降低肿瘤组织中p-AKT和Ki-67表达，且无明显体重下降。该研究表明BF通过下调p-AKT发挥抗黑色素瘤和抗血管生成作用，为黑色素瘤治疗提供了新的机制依据和潜在药物。相关成果发表于《Cancer Reports》。

研究人员运用的主要关键技术方法包括：细胞增殖活性检测（CCK-8）和集落形成实验；流式细胞术检测凋亡和细胞周期；划痕实验和Transwell小室实验评估迁移与侵袭；Matrigel管形成实验评估血管生成能力；通过网络药理学数据库（Pharmmapper、MalaCards、GENECLIP）筛选靶基因并进行GO、KEGG通路富集、蛋白互作网络分析和MCODE模块分析；利用Schr?dinger软件进行分子对接；蛋白质印迹检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达，并使用SC-79进行救援实验；体内实验采用A375细胞皮下接种BALB/c裸鼠，给予1.5 mg/kg/day蟾蜍灵腹腔注射，结合免疫组化检测肿瘤组织p-AKT和Ki-67表达。细胞系来源：A375和A2058及HUVEC均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海）。

研究结果分述如下：

BF抑制黑色素瘤细胞生长并促进凋亡：CCK-8结果显示，BF对A375细胞的24小时和48小时半数抑制浓度（IC₅₀）分别为20 nM和17.5 nM，对A2058细胞分别为60 nM和30 nM。集落形成实验显示，随着BF浓度增加，集落数量显著减少。流式凋亡检测显示，对照组凋亡细胞比例<5%，10 nM处理组为10%–20%，20 nM处理组为30%–40%，说明BF可促进黑色素瘤细胞凋亡。周期分析显示，10 nM和20 nM BF处理后，G2/M期细胞比例显著增加，提示BF将细胞阻滞于G2/M期。

BF抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭：划痕实验显示，A375和A2058细胞经5 nM和10 nM BF处理12小时后，迁移能力显著减弱，划痕间距增宽。Transwell迁移实验显示，BF处理组迁移至下室的细胞数较对照组减少；侵袭实验中，5 nM和10 nM BF处理后细胞侵袭能力显著下降，侵袭细胞数明显减少。

BF抑制HUVEC的生长、迁移和管状结构形成：CCK-8实验显示，BF以剂量依赖方式抑制HUVEC活力，24小时IC₅₀为40 nM，48小时IC₅₀为20 nM。集落形成实验进一步证实BF抑制HUVEC增殖。划痕实验中，5 nM和10 nM BF处理后伤口宽度显著大于对照组。Transwell实验显示，随着BF浓度增加，迁移细胞数减少。Matrigel血管形成实验中，10 nM BF处理后血管网络数量显著减少，管状结构被破坏，表明BF抑制HUVEC管形成。

生物信息学分析提示PI3K-AKT信号通路是BF抑制黑色素瘤的主要通路：通过Pharmmapper、MalaCards和GENECLIP数据库交叉筛选获得57个关键靶点。GO分析显示，主要生物学过程涉及刺激应答和生物调节，分子功能以蛋白结合、离子结合和转移酶活性调控为主，细胞组分包括细胞核、细胞质和细胞膜。KEGG富集分析筛选出20条相关通路，其中PI3K-AKT通路排名第一。MCODE模块分析也提示PI3K-AKT通路为最重要的信号通路。

BF减少AKT磷酸化：蛋白互作网络分析显示MAPK、AKT1和p53为交互最多的核心基因。分子对接模拟结果显示BF与AKT1在第53位天冬酰胺（ASN 53）形成氢键，对接得分为?3.956，提示两者存在相互作用。蛋白质印迹实验显示，BF处理后黑色素瘤细胞和血管内皮细胞中PI3K蛋白水平无明显变化，但p-AKT蛋白水平显著降低，表明BF抑制AKT磷酸化。使用AKT激活剂SC-79进行救援实验，结果显示加入SC-79后p-AKT表达增加，而BF可逆转这一效应。

Bufalin抑制异种移植模型肿瘤生长：采用A375细胞建立裸鼠皮下异种移植模型，与对照组相比，蟾蜍灵处理组肿瘤生长明显减缓，最终肿瘤体积和重量显著降低。实验期间小鼠体重无明显下降，提示蟾蜍灵在所用剂量下无明显全身毒性。免疫组化染色显示，蟾蜍灵处理组肿瘤组织中p-AKT和Ki-67表达较对照组显著降低。

讨论部分指出，BF在肺癌、结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤中均表现出抗肿瘤活性，涉及PI3K/AKT、Hedgehog、MAPK/JNK、Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、整合素信号通路和NF-κB等通路。既往关于BF在黑色素瘤中的研究仅涉及Na⁺/K⁺/ATPase泵或糖酵解关键酶PKM2，未进行深入机制分析。本研究通过网络药理学筛选和生物信息学富集，确定PI3K-AKT信号通路为关键通路，并通过分子对接和蛋白质印迹实验证实BF与AKT1结合并抑制其磷酸化。SC-79救援实验结果进一步验证了BF对AKT磷酸化的抑制作用。结论部分翻译如下：总之，本研究表明蟾蜍灵通过降低p-AKT蛋白水平发挥抗黑色素瘤作用，导致BRAF突变黑色素瘤细胞出现凋亡和G2/M期阻滞。鉴于AKT是调控细胞存活和增殖的核心激酶，该研究确立p-AKT为蟾蜍灵作用的关键机制节点。这些结果的临床适用性有两方面：第一，由于p-AKT下调足以触发抗肿瘤效应，且不受BRAF突变状态限制，蟾蜍灵可能对广谱黑色素瘤有效，包括对BRAF/MEK抑制剂耐药的肿瘤；第二，蟾蜍灵作为中药中已使用的天然化合物，可被重新定位为辅助治疗药物，以增强现有治疗疗效或克服耐药。未来研究应在临床前模型中探索蟾蜍灵与靶向药物或免疫疗法的联合应用，并评估其在黑色素瘤患者中的安全性和药代动力学。总体而言，该工作为蟾蜍灵作为潜在抗黑色素瘤药物的临床开发提供了机制依据。