《Aging Cell》：3D Culture Reverses Limbal Niche Cell Replicative Aging via FOSL1 Upregulation
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角膜缘微环境细胞（LNCs）是角膜缘微环境稳态和角膜上皮损伤修复的关键调节因子，是角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）的一种有前景的治疗资源。然而，其临床应用受到体外扩增过程中复制性衰老的制约。在本研究中，研究人员探讨了基于Matrigel的三维（3D）培养系统能否
角膜缘微环境细胞（LNCs）是角膜缘微环境稳态和角膜上皮损伤修复的关键调节因子，是角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）的一种有前景的治疗资源。然而，其临床应用受到体外扩增过程中复制性衰老的制约。在本研究中，研究人员探讨了基于Matrigel的三维（3D）培养系统能否调节LNCs的复制性衰老。与常规二维（2D）培养相比，3D培养的LNCs恢复了干性标志物表达并增强了增殖能力。同时，这些细胞表现出衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性降低，以及衰老相关蛋白（包括p16、p21、p53和γ-H2AX）表达减少。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析揭示了FOS样抗原1（FOSL1）的显著上调。FOSL1是AP-1转录因子家族的成员，参与细胞增殖和应激适应。使用体外复制性衰老模型的功能实验表明，在早期传代（P4）LNCs中敲低FOSL1加速衰老，而在晚期传代（P11）LNCs中过表达FOSL1则减轻衰老。机制上，FOSL1敲低诱导线粒体功能障碍，表现为线粒体超氧化物和细胞活性氧（ROS）水平升高，以及线粒体膜电位下降，而FOSL1过表达则维持了线粒体完整性和功能。总之，研究人员的发现表明，3D培养通过FOSL1介导的线粒体功能增强逆转LNC复制性衰老，为角膜再生治疗中对抗成体干细胞复制性衰老提供了一种基于微环境的策略。
研究背景：角膜的透明性与良好视觉功能依赖于角膜缘上皮干细胞（LESCs）的储备。LESCs缺乏或功能障碍会导致角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），这是一种以角膜上皮结膜化为特征的难治性眼表疾病。角膜缘微环境细胞（LNCs）来源于角膜缘前基质，具有间充质干细胞（MSCs）特征，是微环境的关键调节因子，在维持角膜上皮稳态和促进无瘢痕修复中发挥重要作用。然而，体外扩增过程中的复制性衰老限制了LNCs的临床转化。线粒体能量代谢中心的衰退是细胞衰老的核心特征之一，表现为呼吸功能受损、ATP减少及活性氧（ROS）累积。传统二维（2D）培养难以模拟体内微环境，导致干细胞特性丧失。因此，探索能够逆转LNC复制性衰老的培养策略极为必要。该研究发表于《Aging Cell》。
研究人员构建了基于Matrigel的三维（3D）半球形液滴培养系统，比较了2D与3D培养条件下LNCs的增殖能力、干性维持和衰老表型；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析细胞亚群变化；结合差异表达分析筛选关键调控因子FOSL1，并通过siRNA敲低和质粒过表达在体外复制性衰老模型中验证其功能；进一步检测ROS、线粒体超氧化物、线粒体膜电位及超微结构。结果表明，3D培养通过上调FOSL1增强线粒体功能，从而逆转LNC复制性衰老。
主要技术方法：角膜组织取自武汉同济医院红十字眼库60–80岁供体；分离纯化获得LNCs（P4）。建立Matrigel 3D培养系统与2D对照组。采用scRNA-seq（BD Rhapsody平台、Illumina NovaSeq测序）结合Seurat、Harmony、Monocle2等流程分析亚群。利用siRNA和过表达质粒调控FOSL1。通过免疫荧光（IF）、Western blot（WB）、RT-qPCR检测标志物；SA-β-gal染色评估衰老；DCFH-DA、MitoSOX Red、JC-1和透射电镜（TEM）检测线粒体功能。
研究结果：
3.1 LNCs在3D培养中自组装成球体：通过免疫荧光和相差显微观察，研究人员确认培养至P4的LNCs高表达Vim、CD73、CD90，不表达上皮标志物PCK，获得纯度较高。在Matrigel 3D系统中，LNCs自发形成球体，且直径在6天内逐渐增大。
3.2 与2D培养相比，3D培养逆转LNC衰老：Ki67免疫荧光和CCK-8实验显示3D培养增强LNC增殖；干性标志物SOX2、OCT4、NANOG表达显著上调；SA-β-gal阳性细胞比例下降，衰老相关蛋白p16、p21、p53及DNA损伤标志γ-H2AX表达降低。
3.3 3D培养通过亚群重塑减弱LNC衰老：scRNA-seq识别出10个细胞亚群（C0–C9）。其中2D培养中富集的衰老倾向亚群C2和C3（富集细胞衰老和p53信号通路）在3D培养中显著减少，而增殖活跃、富集DNA复制的C5亚群显著增加。
3.4 FOSL1在3D培养调节细胞衰老中发挥关键作用：基因集评分显示3D培养显著上调多能性相关转录特征，下调衰老相关特征。差异表达筛选出21个候选“年轻化”调节因子，其中FOSL1为AP-1转录因子家族成员。晚期传代（P11）LNCs中FOSL1 mRNA和蛋白水平均较P4显著下降。
3.5 FOSL1作为抗衰老调节因子的功能验证：在P4 LNCs中敲低FOSL1增加SA-β-gal阳性细胞，降低Ki67阳性率，上调p16、p21、p53、γ-H2AX；在P11 LNCs中过表达FOSL1则减少衰老细胞比例，恢复增殖能力并下调上述衰老标志物。
3.6 FOSL1影响线粒体功能：FOSL1敲低导致细胞内ROS和线粒体超氧化物增多，线粒体膜电位下降，TEM显示线粒体肿胀、嵴结构破坏和空泡化；FOSL1过表达则降低ROS水平，恢复线粒体膜电位和有序嵴结构。
讨论总结：研究人员认为，3D培养通过增强细胞-细胞及细胞-细胞外基质相互作用，激活PI3K/AKT和MAPK等存活信号通路，抑制应激诱导的衰老程序，从而维持MSCs的“年轻”状态。FOSL1表达随细胞衰老而下降，其作为AP-1家族核心亚基，可能通过激活NRF2抗氧化通路和维持线粒体健康来清除ROS，并通过与FOS、JUN、MAF、EGR1等转录因子相互作用协调应激适应和蛋白质稳态。临床应用中，3D培养和FOSL1激活有望为LSCD治疗提供充足、标准化的LNC产品。研究局限性在于尚未进行动物体内验证，FOSL1下游具体分子通路仍待阐明。
结论翻译：本研究表明，基于Matrigel的3D培养系统比传统2D培养更接近天然角膜缘。3D环境促进LNCs自发球体形成，并有效逆转其复制性衰老。结果显示，3D培养的LNCs中FOSL1表达显著增加。FOSL1是AP-1家族转录因子，也是细胞衰老的关键负调控因子。功能验证表明，敲低FOSL1可加速早期传代细胞的衰老，而过表达FOSL1可减轻衰老相关表型并增强增殖能力。这些发现确立了FOSL1作为增强LNC功能的潜在新型治疗靶点，并为基于LNC的LSCD治疗策略提供了基础。
