何首乌中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）通过抑制ZBP1/PANoptosis信号减轻实验性早发性卵巢功能不全

《Food Science & Nutrition》：TSG From Polygonum multiflorum Thunb. Attenuates Experimental Premature Ovarian Insufficiency in Association With Reduced ZBP1/PANoptosis Signaling

　　

中文摘要翻译： 何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）是东亚地区广泛食用的功能性食品和膳食补充剂。然而，其生物活性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）能否缓解早发性卵巢功能不全（POI）仍不清楚。本研究旨在探讨TSG给药是否通过抑制ZBP1/PANoptosis信号来缓解POI。研究人员采用雷公藤多苷诱导的POI大鼠模型，通过腹腔注射给予TSG治疗。通过动情周期、激素检测（FSH、E2、AMH）和组织病理学评估卵巢功能。通过免疫荧光和Western blot分析ZBP1/PANoptosome的形成及PANoptosis的关键执行分子。在雷公藤甲素损伤的KGN颗粒细胞中，通过评估细胞活力、凋亡、乳酸脱氢酶（LDH）释放以及有无ZBP1过表达情况下的PANoptosis激活来检测TSG的作用。TSG显著恢复POI大鼠的动情周期规律性，改善激素谱并保留卵泡储备。在分子水平上，TSG与ZBP1/PANoptosome形成减少及下游执行分子（如cleaved Caspase-3、N-GSDMD、p-MLKL）降低相关。在细胞实验中，TSG减轻了细胞损伤。至关重要的是，虽然ZBP1过表达加重了损伤并放大了PANoptosis信号，但TSG联合处理显著逆转了这些效应，表明ZBP1/PANoptosis信号可能与TSG对POI的保护作用相关。总之，TSG通过抑制ZBP1/PANoptosis减轻POI，从而加深了对POI发病机制的理解，并使TSG成为进一步研究的候选药物。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40岁之前丧失卵巢功能，通常表现为月经紊乱如月经稀发或闭经、促性腺激素水平升高以及雌激素缺乏的临床体征。POI不仅导致不孕和围绝经期症状，还增加骨质疏松、心血管疾病和认知功能障碍等远期并发症的风险。全球患病率约为3.5%～3.7%，且呈年轻化趋势，对女性健康、家庭幸福和社会人口稳定构成重大威胁。目前的治疗策略主要基于激素替代疗法和辅助生殖技术，这些方法仅能缓解症状，无法解决根本病因，且长期使用可能增加静脉血栓栓塞和激素依赖性恶性肿瘤等风险。因此，深入理解POI的发病机制并开发有效的防治策略仍是生殖内分泌领域的重大优先事项。

POI的病因涉及免疫、遗传、医源性和环境因素，但超过半数病例仍为特发性。程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）的异常激活是破坏卵巢稳态、驱动过度卵泡闭锁并促进POI进展的关键病理事件。PANoptosis是一种新近定义的炎症性PCD模式，其特征为焦亡、凋亡和坏死性凋亡的同步激活及通路间的交叉对话。这一过程由称为PANoptosome的多蛋白复合物控制，该复合物以环境依赖的方式由三种细胞死亡通路的核心分子组分构成。Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）作为先天免疫传感器，是关键的起始上游分子。激活后，ZBP1启动PANoptosome形成，进而激活下游执行分子，包括gasdermin D/E（GSDMD/E）、caspase-3/7和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），最终导致裂解性细胞死亡。尽管已有证据提示PANoptosis参与卵巢功能障碍，且研究人员的既往研究表明颗粒细胞PANoptosis促进POI中过度卵泡闭锁，但ZBP1作为PANoptosis关键调控因子在POI发病中的确切功能尚未明确。

何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥根是东亚地区广泛食用的功能性食品和膳食补充剂，传统上用于促进健康和应对衰老相关疾病。根据中医理论，何首乌被视为补肾中药，而肾虚被认为是POI的核心病机。其主要生物活性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）具有显著的抗衰老、抗氧化、抗炎和免疫调节特性。既往研究表明TSG可延缓氧化应激诱导的Leydig细胞衰老并维持衰老小鼠的卵巢功能。研究人员的既往工作提示该植物水提物可能与调节大鼠血清性激素水平和减缓卵巢功能衰退相关。此外，水提物和分离的TSG均能促进未成熟小鼠子宫发育并上调雌激素受体表达，支持其植物雌激素样活性。更重要的是，研究人员的既往研究显示何首乌提取物可抑制大鼠颗粒细胞PANoptosis，从而限制过度卵泡闭锁并减缓POI进展。然而，其主要活性成分TSG是否通过抑制ZBP1/PANoptosis发挥类似的保护作用仍不清楚。

基于上述背景，本研究通过体内和体外实验，探讨TSG是否通过可能涉及ZBP1/PANoptosis调控的机制改善POI。该研究有望为POI发病机制提供新的认识，并为开发基于TSG的PANoptosis调控策略奠定实验基础。该论文发表在《Food Science》。

二、主要技术方法

研究人员采用多种关键技术方法开展研究。动物实验方面，使用8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠（购自河南斯可贝斯生物科技有限公司），通过每日灌胃雷公藤多苷（75 mg·kg^?1）建立POI大鼠模型，随机分为对照组、模型组、戊酸雌二醇（EV）阳性对照组、TSG低剂量组（10 mg·kg^?1）和TSG高剂量组（40 mg·kg^?1），连续处理28天。通过阴道涂片细胞学监测动情周期，采用HE染色进行卵泡计数，ELISA检测血清FSH、E₂和AMH水平，透射电子显微镜（TEM）观察颗粒细胞超微结构，Western blot检测PANoptosis相关蛋白表达，免疫荧光检测ZBP1/PANoptosome共定位。细胞实验方面，使用人颗粒细胞系KGN细胞（购自普诺赛生命科技有限公司，经STR分型鉴定），以雷公藤甲素（TP）诱导细胞POI模型，通过CCK-8、LDH释放、TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术评估细胞损伤，并通过ZBP1过表达质粒转染验证ZBP1在PANoptosis中的上游调控作用。

三、研究结果

3.1 TSG改善POI大鼠卵巢功能

正常大鼠具有规律的4-5天动情周期，阴道细胞学显示各阶段特征性细胞形态。在28天处理期间，POI模型大鼠主要处于动情间期或动情后期，平均动情周期长度显著延长。TSG高剂量处理有效将周期长度缩短至正常范围。HE染色显示对照组大鼠卵巢皮质结构完整，原始卵泡丰富，而POI大鼠原始卵泡显著减少、闭锁卵泡增多。EV和TSG处理均保留了原始卵泡并减少了闭锁。POI大鼠卵巢指数显著降低，TSG高剂量处理恢复卵巢指数。与对照组相比，POI模型大鼠AMH和E₂降低、FSH升高，EV和TSG高剂量逆转了FSH和E₂变化，TSG高剂量还增加了AMH水平。这些结果表明EV和TSG有效改善POI大鼠卵巢功能。

3.2 TSG处理与POI大鼠PANoptosis减少相关

TEM显示对照组颗粒细胞超微结构正常，而模型组细胞损伤严重，包括核固缩和碎裂、细胞器肿胀、胞质空泡化以及质膜破裂伴胞质内容物外溢，这些特征提示焦亡、凋亡和坏死性凋亡同时存在，符合PANoptosis样细胞死亡。药物干预显著改善这些超微结构病变，TSG高剂量组颗粒细胞超微结构接近正常。Western blot分析显示，与对照组相比，模型组凋亡相关蛋白Caspase-3和cleaved Caspase-3、焦亡执行蛋白GSDMD、N-GSDMD和GSDME以及坏死性凋亡蛋白p-MLKL均显著升高，表明POI大鼠卵巢中焦亡、凋亡和坏死性凋亡通路同步激活。TSG处理显著降低这些蛋白表达。Pearson相关分析显示TSG剂量与cleaved Caspase-3和GSDME表达显著负相关。

3.3 TSG处理大鼠ZBP1/PANoptosome形成减少

Western blot显示POI大鼠ZBP1表达较对照组显著升高，TSG高剂量干预后显著降低。免疫荧光染色显示对照组大鼠卵泡中ZBP1、ASC、Caspase-8和RIPK3表达低且无明显共定位，而POI模型大鼠卵泡颗粒细胞中呈现显著共定位且荧光强度显著升高，表明ZBP1/PANoptosome形成。EV和TSG处理均减弱了这种共定位，TSG高剂量显著降低ZBP1、ASC、Caspase-8和RIPK3的荧光强度。

3.4 细胞POI模型建立与TSG剂量筛选

以TP诱导KGN颗粒细胞损伤建立细胞POI模型，通过CCK-8、LDH释放和TUNEL染色评估，确定1 μM TP处理48小时为最佳造模浓度。TSG剂量筛选显示50 μM处理24小时或10 μM处理48小时可显著减轻TP诱导的损伤，鉴于POI模型为48小时TP处理，后续实验选择10 μM TSG共处理48小时。

3.5 TSG挽救oe-ZBP1加重的细胞损伤

qPCR确认ZBP1过表达成功。模型组细胞活力显著降低、LDH释放增加、凋亡/坏死率升高，TSG干预显著改善这些损伤指标。oe-NC转染不影响细胞活力，而oe-ZBP1加重了TP诱导的细胞损伤，TSG共处理显著逆转这些效应。

3.6 TSG破坏oe-ZBP1促进的PANoptosome形成

免疫荧光显示对照组细胞中Caspase-8、ASC和RIPK3表达极低且无明显共定位。TP诱导的POI模型细胞中这些组分呈现强共定位且荧光强度显著升高。TSG共处理显著降低共定位和荧光强度。ZBP1过表达进一步加重细胞损伤并显著升高PANoptosome共定位和荧光强度，TSG共处理显著逆转这些促损伤效应。

3.7 TSG减弱oe-ZBP1加重的PANoptosis

Western blot显示，与TP+oe-NC相比，TP+oe-ZBP1显著升高Caspase-3、cleaved Caspase-3、GSDMD、N-GSDMD、GSDME和p-MLKL水平，证实ZBP1过表达作为PANoptosis表型的关键上游激活因子。TSG与这些变化的逆转相关。

四、讨论与结论

本研究将既往从粗提物水平推进到明确化合物水平，从表型观察推进到通路聚焦研究。TSG给药与POI大鼠动情周期规律性恢复、卵巢指数恢复、过度原始卵泡耗竭和卵泡闭锁减少相关，从而保留卵巢储备。TSG与POI大鼠激素谱改善相关，表明其恢复卵巢内分泌功能的潜力。机制研究表明，POI模型中焦亡、凋亡和坏死性凋亡的标志性效应蛋白均上调，TSG与其下调相关。研究人员提出TSG通过可能涉及ZBP1这一关键上游传感器的机制维持卵巢稳态，从而减少PANoptosis激活。研究结果揭示POI条件下ZBP1表达升高，促进PANoptosome形成，而TSG处理与ZBP1下调及该复合物组装减少相关。在细胞实验中，ZBP1过表达显著加重TP诱导的细胞损伤并放大PANoptosis信号，TSG共处理仍显著逆转这些效应，表明TSG可能影响ZBP1相关通路。此外，TSG的植物雌激素样活性和抗炎特性可能构成其卵巢保护作用的替代或补充机制。

研究存在若干局限性。首先，缺乏ZBP1功能缺失和免疫共沉淀实验，因果关系尚未完全确立，ZBP1是否为TSG的直接靶点尚待确定。其次，KGN细胞作为颗粒样肿瘤细胞系可能不能完全代表原代颗粒细胞生理。第三，给药方案主要为预防性/联合处理而非治疗性。第四，腹腔注射途径与膳食相关的口服途径不同，口服生物利用度受肠道和肝脏代谢限制，食物基质效应未系统评估。安全性方面，实验期间未观察到明显毒性迹象，所用TSG剂量在已报道的安全范围内，但系统安全性评估超出本研究范围。

结论：研究结果表明TSG可减轻大鼠模型中POI的发展，其方式与抑制ZBP1/PANoptosis相关。然而，当前发现属于机制性证据，需要采用口服给药和适当剂量换算的进一步研究来探索TSG在膳食或补充剂背景下的转化潜力。