坏死性凋亡已被证实在多种临床状况（包括体外循环和肺栓塞）下的肺缺血再灌注损伤（LIRI）进程中发挥作用。已有报道表明，褪黑素通过减轻氧化应激和急性炎症反应在LIRI中发挥保护作用。然而，褪黑素对LIRI中坏死性凋亡的影响仍不清楚。本研究旨在探讨褪黑素对缺氧/复氧（H/R）诱导损伤的保护作用是否与坏死性凋亡的调控以及线粒体功能和氧化应激的相关变化有关。研究人员将细胞暴露于H/R（16/4?h）或常氧条件下，并在存在或不存在2.5?μM褪黑素的情况下进行处理。采用MTT法测定细胞活力，同时通过荧光显微镜使用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EtBr）染色评估H/R暴露引起的BEAS-2B细胞形态学变化。对BEAS-2B细胞进行了机制分析，包括基于流式细胞术的细胞周期评估、凋亡检测（Annexin V-FITC）、线粒体膜电位评估（JC-1）以及活性氧（ROS）测量。还使用酶联免疫吸附测定法对混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）（坏死性凋亡复合物的关键组分）的水平进行了定量。此外，还测定了ATP、pH和乳酸水平。研究结果表明，褪黑素处理降低了H/R诱导的坏死细胞百分比增加，并增加了存活细胞百分比（p?
一、研究背景与目的
肺缺血再灌注损伤（LIRI）是肺移植、体外循环、心肺复苏、单肺通气和肺栓塞等临床状况中常见的严重并发症，可导致呼吸衰竭，也是肺移植术后早期死亡和原发性移植物功能障碍的重要原因。目前针对LIRI尚无特异性的有效治疗方法。
LIRI的病理机制极为复杂，涉及多种分子通路。缺血期可触发肺泡上皮细胞、肺内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中氧化酶的激活和线粒体功能障碍，导致活性氧（ROS）产生增加而清除减少，ROS水平升高。缺血缺氧期间，有氧代谢停滞导致细胞ATP和ADP迅速降解为AMP，氧化磷酸化终止，同时酸性代谢产物蓄积引起组织酸中毒。ATP的快速耗竭损害线粒体膜电位，导致钙离子泄漏至胞质，最终激活细胞死亡通路。
既往研究表明，LIRI涉及凋亡和坏死两种细胞死亡方式，近年来的研究进一步证实坏死性凋亡也参与LIRI的发病过程。坏死性凋亡是一种激酶依赖的程序性死亡通路，其坏死体复合物的主要效应分子包括受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3和混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）。RIPK1磷酸化RIPK3，进而驱动MLKL磷酸化和寡聚化，MLKL随后转位至质膜和线粒体等细胞内生物膜，使膜通透化，执行坏死性凋亡。由于MLKL是坏死体复合物激活的最后步骤且不参与凋亡过程，因此被认为是坏死性凋亡的特异性标志物。已有研究证实MLKL抑制剂坏死磺酰胺对肺、脑和心脏的缺血再灌注（I/R）损伤具有保护作用。
褪黑素是一种受昼夜节律调控的吲哚胺类物质，已证实可通过其抗氧化、抗炎和线粒体保护特性减轻I/R损伤，并可通过调控凋亡和线粒体自噬等细胞死亡通路减轻LIRI。然而，褪黑素与LIRI中坏死性凋亡的关系尚不明确。本研究旨在探讨坏死性凋亡是否参与褪黑素对LIRI的保护作用，并阐明人肺上皮细胞中与坏死性凋亡抑制相关的线粒体膜电位、ROS、ATP、乳酸产生和pH水平的变化。
二、研究设计与方法
研究人员选用人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞（来源于ATCC，ATCC CRL-3588）建立体外H/R损伤模型。细胞在含1% O2、5% CO2和94% N2的低氧培养箱中缺氧16小时，随后在常氧条件下复氧4小时。研究首先通过MTT法筛选最佳缺氧时长和褪黑素的有效浓度及给药方案，确定以2.5?μM褪黑素在H/R全周期给药作为后续实验条件。主要技术方法包括：MTT法检测细胞活力；ATP检测试剂盒评估细胞内ATP水平；AO/EtBr双染和Annexin V-PI染色结合流式细胞术评估细胞死亡类型及比例；酶联免疫吸附测定（ELISA）定量MLKL蛋白水平；JC-1染色评估线粒体膜电位；ROS染色检测细胞内活性氧水平；血气分析仪检测培养基pH和乳酸水平。统计学分析采用GraphPad Prism 10.0软件，数据以均值±标准差表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney U检验。
三、研究结果
3.1 缺氧时长的确定。 研究人员通过MTT法检测不同缺氧时长（0、4、6、12、16、18、24小时）后复氧4小时对细胞活力的影响。结果显示，缺氧16小时（p=0.04）、18小时（p=0.02）和24小时（p=0.006）均显著降低细胞活力，且16、18和24小时之间无显著差异。据此确定H/R周期为缺氧16小时/复氧4小时。
3.2 H/R期间给予褪黑素可提高细胞活力。 MTT结果显示，H/R暴露显著降低细胞活力（p=0.015）。在H/R期间给予2.5?μM（p=0.02）和5?μM（p=0.009）褪黑素可显著提高细胞活力，恢复至接近常氧水平；而10、25、50和100?μM等较高浓度反而显著降低细胞活力。褪黑素呈现非单调剂量反应特征。ATP检测结果与MTT一致，2.5?μM褪黑素显著提高H/R暴露细胞的ATP水平（p=0.02）。
3.3 复氧期间给予褪黑素不影响细胞活力。 缺氧16小时后仅在复氧4小时期间给予不同浓度褪黑素，均未显著改变细胞活力（p>0.05），说明褪黑素需在H/R全周期存在才能发挥保护作用。
3.4 褪黑素维持H/R条件下BEAS-2B细胞形态并减少坏死性细胞死亡。 AO/EtBr染色显示，H/R暴露诱导细胞出现黄橙色和红色荧光，提示早期凋亡、晚期凋亡和坏死。Annexin V-PI流式分析显示，常氧组存活细胞、凋亡细胞和坏死细胞比例分别为97.4%±0.6、0.7%±0.2和1.9%±0.4；H/R暴露后存活细胞显著降至51.8%±2.8（p=0.002），坏死细胞显著升至46.9%±2.7（p=0.002），而凋亡细胞比例无显著变化（1.3%±0.1，p>0.05）。2.5?μM褪黑素显著提高存活细胞至70.5%±0.6（p=0.04），将坏死细胞降至23.7%±0.9（p=0.04），同时凋亡细胞比例轻度升高至5.9%±0.5（p=0.006）。这表明坏死是H/R暴露后BEAS-2B细胞死亡的主要方式，褪黑素显著减少坏死性死亡并使死亡模式轻度向凋亡方向偏移。
3.5 褪黑素降低H/R条件下BEAS-2B细胞的MLKL水平。 ELISA检测显示，H/R显著升高MLKL蛋白水平（p=0.02），2.5?μM褪黑素显著逆转该升高（p=0.04），使其恢复至常氧水平。H/R诱导的总MLKL升高与坏死性死亡占优势一致，提示坏死性凋亡相关信号的参与。
3.6 褪黑素维持H/R条件下BEAS-2B细胞的线粒体膜完整性。 JC-1染色显示，H/R暴露显著降低细胞活力（p=0.007），2.5?μM褪黑素显著改善线粒体膜完整性（p=0.03）。
3.7 褪黑素显著降低H/R条件下BEAS-2B细胞的活性氧水平。 ROS染色显示，H/R显著升高ROS水平（p=0.007），2.5?μM褪黑素显著抑制该升高（p=0.006）。
3.8 褪黑素不改变H/R条件下BEAS-2B细胞的pH水平但逆转乳酸升高。 H/R暴露显著升高乳酸（cLac）水平（p=0.02），pH虽有下降但无统计学意义（p>0.05）。2.5?μM褪黑素有效逆转了乳酸水平的升高。
四、讨论与结论
本研究提示褪黑素可能通过抑制H/R诱导的坏死性凋亡减少BEAS-2B细胞死亡。H/R暴露后人肺上皮细胞以坏死性死亡为主，坏死性凋亡可能参与其中。既往研究已证实坏死性凋亡参与LIRI，RIPK1抑制剂Nec-1和MLKL抑制剂NSA等坏死性凋亡抑制剂在体内外实验中均表现出保护作用。本研究首次证明褪黑素可能通过抑制坏死性凋亡对LIRI发挥保护作用。
在机制层面，MLKL经RIPK3磷酸化后寡聚化并转位至线粒体等细胞器膜，破坏膜完整性导致坏死性死亡。本研究中H/R升高MLKL水平并破坏线粒体膜完整性，而褪黑素恢复MLKL水平并维持线粒体完整性。线粒体在I/R损伤中发挥核心作用，mPTP开放导致线粒体肿胀、膜电位丧失、ATP耗竭和ROS升高。本研究中褪黑素逆转了H/R引起的ATP降低、ROS升高和线粒体膜电位破坏，与既往坏死体激酶抑制研究的结果一致。
褪黑素在本研究中呈现非单调剂量反应特征，仅在2.5–5?μM低浓度范围内发挥保护作用，较高浓度反而有害。且仅在H/R全周期给药时有效，仅在复氧期给药无效，提示褪黑素需覆盖缺血和再灌注全程才能发挥保护作用。
本研究存在一定局限性：未检测磷酸化MLKL（p-MLKL）和上游调控因子（RIPK1/RIPK3）；未使用额外标志物验证H/R模型；生物学重复数较少可能影响统计稳健性。未来需更大样本量的独立重复实验以及体内和转化研究来确证其治疗潜力。
研究结论： 本研究提示褪黑素可能通过抑制坏死性凋亡，至少部分地保护人肺上皮细胞免受H/R诱导的损伤。该保护作用可能与减轻氧化应激、维持线粒体膜完整性和恢复ATP水平有关。这些发现提示褪黑素可能是LIRI的有前景的治疗候选药物，但仍需进一步的体内和转化研究来确证其治疗潜力。
