含苯氧吡啶片段的异喹啉-3-酰胺衍生物的合成及其用于植物保护的抗真菌活性评价

《Chemistry & Biodiversity》：Synthesis and Antifungal Evaluation of Isoquinoline-3-amide Derivatives Containing a Phenoxypyridine Moiety for Plant Protection

　　

为了发现新型绿色抗真菌候选药物，研究人员设计并合成了20种通过引入活性片段苯氧吡啶而得到的3-酰氨基异喹啉衍生物。它们的结构通过1H NMR、13C NMR和高分辨质谱（HRMS）得到验证。化合物X9的结构进一步通过X射线晶体学得以确认。研究人员评估了它们对五种植物病原真菌的抗真菌活性，以开发基于异喹啉的抗真菌剂。其中，化合物X6对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）表现出显著的抗真菌活性，其半数有效浓度（EC50）值为7.55 μg/mL。体内实验表明，在100 μg/mL浓度下，化合物X6对灰葡萄孢菌表现出强大的保护和治疗功效，有效率分别为77.86%和45.45%。分子对接研究证实，异喹啉酰胺化合物与琥珀酸脱氢酶（SDH）具有很强的结合亲和力。分子动力学（MD）模拟揭示，与啶酰菌胺（boscalid）相比，化合物X6与SDH具有更好的口袋空间兼容性和更稳定的结合相互作用。此外，SDH活性测定显示，在4倍EC50浓度下，化合物X6抑制了66.7%的SDH活性，这与啶酰菌胺（75.85%）的效果相当。这些发现表明，含有苯氧吡啶片段的异喹啉衍生物具有用于作物安全的强效杀菌特性，其中化合物X6有望成为一种新型SDH抑制剂候选物。

研究背景与目的

在农药化学领域，开发具有新颖骨架、环境友好且对非靶标生物低毒的候选农药分子始终是研究热点。利用中间体衍生化法或活性亚结构拼接策略寻找高效活性片段，有助于农药创新并降低研发成本。二苯醚或苯氧吡啶结构因其优异的广谱生物活性而备受关注；与二苯醚相比，苯氧吡啶中的吡啶环不仅能带来良好的脂溶性、代谢稳定性和细胞膜穿透性，还能增加与靶标分子发生π-π堆积的概率，从而展现更优越的生物活性。基于此，多种含苯氧吡啶片段的农药分子已被成功开发并在作物保护中发挥重要作用。

同时，异喹啉化合物作为生物碱的重要组成成分，具有广泛的生物活性和药理作用。前期研究中，研究人员发现异喹啉-3-羧酸（IQ3CA）对多种植物病原菌具有优异的广谱杀菌活性。因此，本研究旨在将苯氧吡啶这一高活性片段通过酰胺键拼接到异喹啉-3-羧酸的骨架上，设计合成一系列新型异喹啉-3-酰胺衍生物，以期获得活性更强的抗真菌候选化合物，并探究其作用机制。该研究成果发表于《Chemistry》。

关键技术方法

1. 1.
   化学合成：采用活性亚结构拼接策略，以异喹啉-3-羧酸为起始原料，经过三步反应首先合成带有不同取代基的苯氧吡啶中间体（4a–4t）。具体而言，在碳酸铯催化下，不同取代的苯酚与2-氯-5-乙酰吡啶偶联生成化合物2a–2t；随后转化为肟3a–3t，再经锌粉和盐酸还原得到关键氨基中间体4a–4t。同时，异喹啉-3-羧酸经酰氯化后，与上述氨基中间体在吡啶作用下偶联，最终得到目标化合物X1–X20。所有目标化合物的结构均通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）确证，化合物X9的结构还通过X射线单晶衍射进一步确认。
2. 2.
   抗真菌活性评价：
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     体外活性测试：采用菌丝生长速率法，在50和100 μg/mL浓度下对所有目标化合物进行初筛，针对五种植物病原真菌：灰葡萄孢菌（B. cinerea）、辣椒疫霉菌（P. capsici）、胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、立枯丝核菌（R. solani）和禾谷镰刀菌（F. graminearum）。对初筛抑制率超过60%的化合物进一步测定其半数有效浓度（EC₅₀）。
   • •
     体内活性测试：选取表现突出的化合物X6，在番茄果实上进行损伤接种实验，分别评估其在50和100 μg/mL浓度下的保护作用和治疗作用。啶酰菌胺（boscalid）作为阳性对照。
3. 3.
   作用机制研究：
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     扫描电子显微镜（SEM）观察：通过SEM观察化合物X6处理后灰葡萄孢菌菌丝形态的变化。
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     分子对接：利用AutoDock Tools软件，将化合物X6和X16与来源于酿酒酵母（S. cerevisiae）的琥珀酸脱氢酶（SDH）晶体结构（PDB ID: 9KPT）进行分子对接，分析结合模式和结合能。
   • •
     分子动力学（MD）模拟：使用Gromacs 2023.3软件对X6-蛋白和啶酰菌胺-蛋白复合物进行100 ns的全原子分子动力学模拟，通过均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键数量等参数评估结合稳定性，并计算MM-GBSA结合自由能。
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     SDH酶活性抑制测定：使用商业化试剂盒，测定化合物X6在不同浓度下对从灰葡萄孢菌中提取的粗酶液中SDH活性的抑制效果。

研究结果

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  2.1 化学合成：研究人员成功合成了20个目标化合物X1–X20，并通过波谱数据确认了其结构。
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  2.2 化合物X9的晶体结构：通过X射线衍射分析确认了化合物X9的单晶结构，揭示了异喹啉环与吡啶环、苯环之间的二面角分别为85.5°和3.8°，并形成了两个分子内氢键。
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  2.3 体外抗真菌活性及构效关系（SAR）分析：在100 μg/mL浓度下，化合物X6和X16对灰葡萄孢菌的抑制率超过80%，与啶酰菌胺相当。化合物X6、X14和X16对胶孢炭疽菌的活性优于啶酰菌胺。构效关系分析发现，苯环对位（4-位）的吸电子基团（如氯和氰基）能显著提高活性；卤素取代的活性顺序为Cl > Br > F；邻位取代基的抑制效果通常优于间位；大体积基团（如叔丁基）不利于活性。
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  2.4 体内抗真菌活性：在100 μg/mL浓度下，化合物X6对番茄果实上的灰葡萄孢菌展现出良好的保护效果（77.86%），略低于啶酰菌胺（86.26%）；但其治疗效果（46.45%）优于啶酰菌胺（33.69%）。
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  2.5 扫描电镜观察：SEM图像显示，经化合物X6处理后的灰葡萄孢菌菌丝出现塌陷和皱缩，表明该化合物能有效破坏菌丝结构。
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  2.6 分子对接：分子对接结果显示，化合物X6和X16与SDH的结合能（分别为-6.67和-5.63 kcal/mol）均低于阳性对照啶酰菌胺（-5.33 kcal/mol），表明它们具有更强的结合亲和力。X6主要通过氢键与SDH活性位点的TRP-194和TYR-120残基相互作用。
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  2.7 分子动力学模拟：100 ns的MD模拟结果表明，X6-蛋白复合物的RMSD值迅速稳定在约0.3 nm，且在模拟过程中平均形成两个稳定的氢键。相比之下，啶酰菌胺-蛋白复合物在前30 ns内经历了严重的构象波动，并在后期发生了配体位移，未能实现稳定结合。MM-GBSA计算进一步证实X6的总结合自由能（-47.05 kcal mol^-1）显著优于啶酰菌胺（-35.19 kcal mol^-1）。
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  2.8 SDH酶抑制活性测定：SDH酶活性测定结果显示，化合物X6能以浓度依赖的方式显著抑制灰葡萄孢菌SDH的活性。在4倍EC₅₀浓度下，其抑制率达到66.7%，与阳性对照啶酰菌胺（75.85%）相当。

总结与讨论

本研究通过活性亚结构拼接策略，成功将苯氧吡啶片段引入异喹啉-3-羧酸骨架，设计合成了一系列异喹啉-3-酰胺衍生物。综合体外、体内抗真菌活性评价以及分子对接、分子动力学模拟和SDH酶活性抑制实验的结果，研究人员得出结论：含有苯氧吡啶片段的异喹啉衍生物具有强效的杀菌特性，可用于作物保护。其中，化合物X6对灰葡萄孢菌表现出优异的抑制活性，其体内治疗效果甚至优于商品化药剂啶酰菌胺。多层面的机制研究表明，X6能够通过稳定的氢键相互作用与SDH紧密结合，并有效抑制其酶活性，因此X6有望成为一种新型SDH抑制剂的候选分子。