《Chemistry & Biodiversity》：Phytochemical Profiling and Evaluation of Antibacterial, Anticancer, Anti-inflammatory, and Wound-Healing Activities of Endophytic Fungi Isolated From Atalantia racemosa
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内生真菌被认为是具有显著药物开发潜力的结构多样性次级代谢产物的丰富来源。本研究从芸香科（Rutaceae）民族药用植物Atalantia racemosa的健康组织中分离内生真菌，该植物传统上用于呼吸系统疾病治疗和血液净化。共获得三株真菌分离物，基于形态学和分
内生真菌被认为是具有显著药物开发潜力的结构多样性次级代谢产物的丰富来源。本研究从芸香科（Rutaceae）民族药用植物Atalantia racemosa的健康组织中分离内生真菌，该植物传统上用于呼吸系统疾病治疗和血液净化。共获得三株真菌分离物，基于形态学和分子（ITS测序）分析鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）、格孢菌目（Pleosporales）sp.和Endothia sp.。对分离物的粗提物采用GC–MS、FTIR和LC–MS技术进行植物化学表征。GC–MS分析显示存在脂肪酸、甾醇、酚类和萜类化合物，而FTIR分析确认了羟基、羰基和芳香基团等关键官能团。重要的是，LC–MS分析提供了高分辨率代谢物谱，在正负电离模式下鉴定出多种生物活性化合物，包括生物碱、黄酮类、奎宁酸衍生物、氧杂蒽酮类（山竹素衍生物）、酚酰胺类（N-阿魏酰章鱼胺）、二萜类、查尔酮类、大环内酯类和萜内酯类。生物学评价表明其具有显著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌和伤口愈合活性，其中Endothia sp.表现出优异的抗癌活性（IC50：19.37 μg/mL）和显著的伤口愈合潜力。LC–MS数据的整合凸显了这些真菌分离物的代谢多样性和药理学相关性。总体而言，该研究证实与A. racemosa相关的内生真菌是具有生物活性代谢物的有前景来源，在药物发现中具有潜在应用价值。
论文解读：Atalantia racemosa内生真菌的植物化学特征及多维度生物活性研究
一、研究背景与研究意义
内生真菌（endophytic fungi）是一类定殖于植物组织内部而不引起宿主明显病症的微生物，自1866年德国科学家Heinrich Anton de Bary提出"内生菌"概念以来，该类微生物因其丰富的次级代谢产物合成能力而受到广泛关注。内生真菌与宿主植物之间存在着从共生到拮抗的复杂生态关系，其产生的代谢物不仅有助于宿主适应环境胁迫，还构成了药物先导化合物的重要来源。已有研究表明，内生真菌可产生生物碱、肽类、甾体及酚类等多种具有抗菌活性的化合物，在医学领域具有广阔的应用前景。
Atalantia racemosa隶属于芸香科（Rutaceae），在泰米尔语中被称为Kattu naragam，主要分布于印度半岛和西高止山脉地区。该植物的叶片煎剂传统上用于治疗支气管炎、哮喘和咳嗽，并具有净化血液的功效。尽管该植物具有重要的民族药用价值，但其内生微生物群落此前几乎未被系统研究。考虑到芸香科其他成员如柑橘属（Citrus）和木橘属（Aegle marmelos）的内生真菌已显示出显著的抗菌和生物活性潜力，对A. racemosa内生真菌的深入研究有望填补该领域的空白，为新型天然产物的发现提供重要资源。基于此，本研究旨在从A. racemosa中分离和鉴定内生真菌，并通过GC-MS和FTIR等技术筛选其生物活性化合物，以评估其在生物医学领域的应用潜力。
二、主要技术方法
研究人员于2024年3月在印度卡纳塔克邦贝尔高姆区Khanapur Taluk的Jamboti地区采集健康成熟植物样本，在24小时内于实验室处理以减少污染。内生真菌的分离采用表面消毒结合PDA培养基培养的方法，通过形态学观察和18S rRNA内转录间隔区（ITS）测序进行分子鉴定，序列提交至NCBI GenBank数据库，并使用MEGA 11软件通过邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。次级代谢产物提取采用75%乙醇浸泡和浸渍法获得粗提物。化学表征方面综合运用了傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析官能团、气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析挥发性成分、液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行高分辨率代谢物谱分析，以及三氯化铝比色法测定总黄酮含量。生物学活性评价涵盖DPPH自由基清除实验（抗氧化）、琼脂孔扩散法（抗菌）、MTT法（细胞毒性和抗癌）、牛血清白蛋白变性抑制实验（抗炎）以及细胞划痕实验（伤口愈合）。
三、研究结果
3.1 内生真菌的分离与分子鉴定
从A. racemosa叶片中共分离获得三株内生真菌，经形态学特征、生殖结构和分子系统发育分析，鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）、格孢菌目（Pleosporales）sp.和Endothia sp.，其GenBank登录号分别为PV569472、PV569473和PV569474。
3.2 粗提物得率
三株真菌的乙醇粗提物得率分别为：A. flavus为31.26%（w/w），Pleosporales sp.为40.41%（w/w），Endothia sp.为11.66%（w/w），表明不同菌株的代谢物产量存在显著差异。
3.3 FTIR分析
FTIR光谱分析确认了提取物中活性成分的官能团特征。A. flavus提取物中检测到醇类（O─H伸缩）、烷烃（C─H伸缩）、共轭烯烃（C═C伸缩）和伯醇（C─O伸缩）；Pleosporales sp.提取物中检测到仲胺（N─H伸缩）、胺盐和磺酰氯（S═O伸缩）；Endothia sp.提取物中检测到烷烃、共轭烯烃、磺酰氯、伯醇、胺类（C─N伸缩）和烯烃（C═C弯曲）。
3.4 总黄酮含量
采用AlCl3法以槲皮素为标准品测定总黄酮含量，结果显示A. flavus为23.32%，Pleosporales sp.为35.32%，Endothia sp.为31.72%，表明Pleosporales sp.的黄酮类化合物含量最高。
3.5 GC-MS分析
GC-MS分析从三种真菌乙醇提取物中各鉴定出30种植物化学化合物。A. flavus中主要化合物为阿比特龙（Abiraterone，峰面积33.08%）和麦角甾醇（Ergosterol，8.05%）；Pleosporales sp.中主要化合物为十六酸乙酯（Hexadecanoic acid ethyl ester，18.76%）和(E)-9-十八碳烯酸乙酯（12.00%）；Endothia sp.中主要化合物为山梨醇（Sorbitol，19.81%）和氨基甲酸衍生物（6.75%）。这些化合物涵盖脂肪酸、甾醇、生物碱、酚类、萜类等多种结构类型。
3.6 LC-MS分析
LC-MS高分辨率代谢物谱分析揭示了三种真菌提取物的化学多样性。A. flavus提取物中鉴定出包括4-甲基-5-噻唑乙醇、依西美坦衍生物、诺美孕酮醋酸酯衍生物、山竹素三甲醚、N-阿魏酰章鱼胺、黄酮醇衍生物和奎宁酸衍生物等化合物，负离子模式下还检测到波美黄酮（Pomiferin）、沃克里斯汀（Voacristine）、厚朴酚（Honokiol）等。Pleosporales sp.提取物中主要含山竹素三甲醚、阿利苯多（Alibendol）、N-阿魏酰章鱼胺、羟基苯甲醛衍生物和奎宁酸衍生物，负离子模式下检测到异樱花素（Isosakuranetin）、亚油酸、反油酸和厚朴酚。Endothia sp.提取物中代谢物种类最为丰富，包括(-)-象牙酮宁（Eburnamonine）、盐尼酮A（Saliniketal A）、墨西哥兰内酯衍生物、蚜青素（Aphidicolin）、三甲氧基查尔酮、亚油酸、大环内酯衍生物和萜内酯等。
3.7 抗氧化活性
DPPH自由基清除实验显示，三种真菌提取物均表现出一定的清除活性，但低于标准品抗坏血酸。在250 μg/mL浓度下，A. flavus的抑制率为58.01±0.386%，Pleosporales sp.为50.66±0.18%，Endothia sp.为43.23±0.23%，而抗坏血酸为81.59±0.5%。IC50值分别为A. flavus 225 μg/mL、Pleosporales sp. 255 μg/mL、Endothia sp. 276 μg/mL，标准品为104 μg/mL。
3.8 抗菌活性
琼脂孔扩散法结果显示，三种提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）均具有抑制活性。对S. aureus的最大抑制圈为A. flavus 19 mm（120 μg）、Pleosporales sp. 14 mm（120 μg）、Endothia sp. 20 mm（90 μg）；对E. coli的最大抑制圈为A. flavus 16 mm（120 μg）、Pleosporales sp. 13 mm（90 μg）、Endothia sp. 5 mm（120 μg）。对照药物环丙沙星（30 μg）的抑制圈为30 mm（S. aureus）和28 mm（E. coli）。
3.9 细胞毒性与抗癌活性
MTT实验评估了提取物对非癌性L929成纤维细胞系和皮肤癌A375细胞系的活性。在L929细胞中，250 μg/mL浓度下细胞活力分别为A. flavus 32.70±2.82%、Pleosporales sp. 28.63±0.62%、Endothia sp. 31.66±1.14%，显示高浓度下具有一定细胞毒性。在A375皮肤癌细胞系中，250 μg/mL浓度下细胞活力分别为A. flavus 36.93%、Pleosporales sp. 20.38%、Endothia sp. 31.30%，顺铂（15 μg/mL）为8.67%。IC50值分别为A. flavus 209.46 μg/mL、Pleosporales sp. 152 μg/mL、Endothia sp. 19.37 μg/mL，其中Endothia sp.表现出最优异的抗癌活性。形态学观察显示，处理组细胞数量随浓度增加逐渐减少，细胞间出现间隙。
3.10 抗炎活性
蛋白质变性抑制实验显示，在250 μg/mL浓度下，阿司匹林标准品的抑制率为85.81%，A. flavus为49.26%，Pleosporales sp.为67.25%，Endothia sp.为58.61%，表明Pleosporales sp.具有相对较好的抗炎潜力。
3.11 伤口愈合活性
细胞划痕实验结果显示，在12小时和24小时时间点，标准品抗坏血酸的细胞迁移分别为27.70 μm和19.44 μm，伤口闭合率分别为68.09%和95.17%。三种真菌提取物中，Endothia sp.在12小时表现出最高的细胞迁移（14.94 μm）和伤口闭合率（44.54%），24小时伤口闭合率达75.10%；A. flavus和Pleosporales sp.在24小时的伤口闭合率分别为72.74%和72.95%。未处理组的伤口闭合率仅为7.50%（12小时）和17.17%（24小时）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，内生真菌作为植物组织内无症状栖息的微生物，显著贡献于宿主植物的生化储备，进而影响其药用特性。全球约80%的非洲、亚洲和拉丁美洲人口仍依赖传统医学，这凸显了对这些植物及其相关内生真菌产生的生物活性化合物进行深入研究的迫切性。与土壤真菌相比，内生真菌具有更强的代谢能力，可产生甾体、生物碱、酚类和萜类等多种生物活性化合物，具有抗癌、抗菌、抗氧化和抗炎等活性，是药物发现的重要资源。本研究中GC-MS分析鉴定出的化合物与已有文献报道的A. flavus和Pleosporales sp.代谢物谱存在差异，反映了不同宿主来源和培养条件对真菌代谢的影响。LC-MS分析进一步证实了这些真菌分离物能够产生结构多样的次级代谢产物，涵盖多种生物合成类别。
研究结论表明，从A. racemosa中分离的三株内生真菌（A. flavus、Pleosporales sp.和Endothia sp.）是生物活性代谢物的丰富来源。其中Endothia sp.在抗癌活性方面表现最为突出（IC50：19.37 μg/mL），同时具有显著的伤口愈合潜力；Pleosporales sp.在抗炎和总黄酮含量方面表现较优；A. flavus在抗氧化和抗菌活性方面具有优势。该研究填补了A. racemosa内生真菌研究的空白，证实了这些真菌分离物作为新型药物先导化合物来源的潜力，为后续活性化合物的分离纯化和结构鉴定奠定了基础。该论文发表于《Chemistry》期刊。
