Piezo通道通过调控经典Wnt信号通路参与成牙本质细胞终末细胞分化

《International Journal of Oral Science》：Piezo channels contribute to the terminal cytodifferentiation of odontoblasts via modulation of canonical Wnt signaling

　　

Piezo1和Piezo2是将机械刺激转导为细胞内生化信号的机械敏感离子通道，在多种组织和器官系统中发挥作用。它们在成牙本质细胞发育中的功能尚不十分清楚。在本研究中，研究人员发现Piezo1和Piezo2在成牙本质细胞终末细胞分化过程中呈现动态表达，提示其在该过程中具有功能作用。然而，利用Wnt1-Cre介导的成牙本质细胞Piezo1敲除（Piezo1 cKO）在大多数Piezo1 cKO小鼠中未引起牙齿发育的明显结构改变。Piezo2 cKO同样未表现出明显的牙齿缺陷。因此，研究人员采用了双敲除策略。对Wnt1-Cre介导的Piezo1和Piezo2双敲除（Piezo1/Piezo2 dKO）小鼠的表型分析显示，成牙本质细胞的细胞分化和形态改变受损。具体而言，Piezo1/Piezo2 dKO小鼠的成牙本质细胞层和成釉细胞层高度低于对照组，且成牙本质细胞终末分化标志物（包括I型胶原蛋白和碱性磷酸酶）的表达出现延迟。此外，核内β-catenin和Wnt10a水平显著降低，提示Wnt/β-catenin信号通路受损。值得注意的是，在离体器官培养体系中，外源性Wnt10a蛋白的应用挽救了Piezo1/Piezo2 dKO牙齿的成牙本质细胞表型。此外，腹腔注射Piezo1通道激动剂Yoda1可促进新生期牙髓组织中成牙本质细胞的细胞分化并升高Wnt/β-catenin信号通路水平。综上所述，这些数据表明Piezo通道通过调控Wnt/β-catenin信号通路在成牙本质细胞终末分化中发挥作用。

论文解读：Piezo通道通过调控经典Wnt信号通路参与成牙本质细胞终末分化

一、研究背景与科学问题

牙齿是重要的咀嚼器官，其发育过程涉及上皮-间充质之间的相互诱导作用以及复杂的时空模式调控。在牙齿发育过程中，由神经嵴细胞（NCCs）来源的间充质细胞形成牙髓组织，其中与上皮层直接接触的最外层细胞从立方状伸长分化为柱状极性细胞，即成牙本质细胞。成牙本质细胞终末分化后开始分泌基质形成牙本质，同时内釉上皮细胞分化为成釉细胞并沉积基质形成牙釉质。这一精细的发育过程受复杂的遗传网络调控，同时也受到生物力学刺激的显著影响。

Piezo通道是机械敏感离子通道，能够将机械信号转导为细胞内生化信号。Piezo1和Piezo2是Piezo家族的两个成员，具有超过40%的序列同源性。Piezo1在多种组织和器官系统中广泛表达，发挥重要功能；而Piezo2主要在神经组织中发挥作用，传导机械感觉和躯体感觉信号。已有研究表明，Piezo通道在骨骼系统发育中发挥关键作用，但其在牙齿发育中的功能仍不清楚。虽然Piezo1和Piezo2在成熟成牙本质细胞中均有表达，并被认为参与出生后牙齿发育的调控机制，但它们在前成牙本质细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究。因此，研究人员利用条件性基因敲除模型和药理学方法，系统探讨了Piezo通道在成牙本质细胞分化中的功能及其分子机制。

二、研究内容与主要结论

该研究发表于《International Journal of Oral Science》，通过多种遗传学和药理学手段，揭示了Piezo1和Piezo2协同调控成牙本质细胞终末分化的功能。研究发现，Piezo通道通过调控经典Wnt信号通路参与成牙本质细胞的终末分化，这一发现为理解牙齿发育的机械调控机制提供了新的视角，也为牙本质形成相关疾病的病因学研究提供了新的线索。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术手段：利用Wnt1-Cre2转基因小鼠系建立Piezo1单敲除（cKO）、Piezo2 cKO及Piezo1/Piezo2双敲除（dKO）小鼠模型，所有小鼠品系均购自Jackson Laboratory；采用RNAscope原位杂交技术检测Piezo1、Piezo2和Wnt10a的mRNA表达；利用免疫荧光染色检测β-catenin、Axin2、Dspp、Alpl、Col1a1等蛋白表达；开展离体牙胚器官培养实验验证Wnt10a的挽救效应；通过腹腔注射Piezo1激动剂Yoda1进行药理学激活实验；采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学分析，并使用显微CT（μCT）进行牙本质厚度测量。

四、研究结果

1. Piezo1和Piezo2在成牙本质细胞终末分化和牙本质形成过程中的稳健表达

通过RNAscope和抗体染色，研究人员检测了牙齿发育各阶段Piezo1和Piezo2的表达模式。在E18.5晚期钟状期，前成牙本质细胞和牙髓细胞中可检测到微弱的Piezo1表达，前成釉细胞层也有表达。在新生期（P0），即成牙本质细胞终末分化的关键时间点，成牙本质细胞层中Piezo1转录本出现显著高表达，且首先在牙尖区域（成牙本质细胞分化最先进的部位）变得明显。Piezo2转录本也在该时期的成牙本质细胞中表达，但水平相对较低。在Piezo1/Piezo2 dKO小鼠中，成牙本质细胞层的Piezo1和Piezo2转录本显著减少，证实了基因敲除的有效性。Piezo1蛋白表达在P7和P28等出生后早期阶段持续存在于成牙本质细胞中，表明Piezo通道可能参与成牙本质细胞分化和牙本质形成过程。

2. Piezo1 cKO和Piezo2 cKO小鼠的牙齿发育

利用Wnt1-Cre2介导的条件性敲除，研究人员发现大多数Piezo1 cKO小鼠的牙齿发育基本正常。Piezo2 cKO小鼠因呼吸窘迫在出生时死亡，但未检测到明显的牙齿发育改变。因此，单个Piezo基因在神经嵴细胞中的敲除未在新生期引起明显的牙齿缺陷，提示Piezo1和Piezo2之间可能存在功能冗余。

3. Piezo1和Piezo2双敲除损害成牙本质细胞细胞分化

在E18.5及更早阶段，Piezo1/Piezo2 dKO小鼠未出现明显的牙齿结构变化。PHH3染色和TUNEL检测显示细胞增殖和凋亡无显著差异。然而在新生期（P0），dKO小鼠的成牙本质细胞层和成釉细胞层高度显著降低。成牙本质细胞分化标志物Dspp、Alpl和Col1a1的表达均减少。在P0后期死亡的小鼠中，虽然突变体成牙本质细胞能够继续沉积基质，但成釉细胞层高度仍低于对照组，提示成釉细胞也受到成牙本质细胞分化受损的继发影响。dKO小鼠的牙齿形态常出现异常，不同区域的牙胚形态发生受影响程度不一致。

4. Piezo1/Piezo2 dKO小鼠细胞分化过程中Wnt信号受损

鉴于Wnt信号在牙齿发育全过程中的关键作用，研究人员检测了Wnt信号通路的关键分子。在E19.5和P0阶段，dKO小鼠中β-catenin-pY489和Wnt10a水平一致降低。Axin2（β-catenin的下游靶基因和Wnt信号的负反馈调节因子）的表达水平在dKO小鼠中也低于对照组。这些结果提示Piezo通道可能调控成牙本质细胞中的Wnt信号通路。

5. Wnt信号恢复挽救了Piezo1/Piezo2 dKO小鼠的牙齿发育

为验证Wnt/β-catenin信号是Piezo信号的下游靶点，研究人员开展了离体牙胚器官培养实验。从E14.5开始培养牙胚，培养8天后加入Wnt10a蛋白。结果显示，dKO牙胚的成牙本质细胞层和成釉细胞层高度低于对照组，而Wnt10a处理后的dKO牙胚的细胞层高度恢复至与对照组相当的水平。Wnt10a补充还使dKO样本中的β-catenin-pY489恢复至正常水平，Col1a1表达也得到恢复。

6. Yoda1上调发育中牙齿的Wnt信号

研究人员通过腹腔注射Piezo1激动剂Yoda1对孕鼠进行处理。在P0阶段，Yoda1处理组小鼠的成牙本质细胞在整个成牙本质细胞层中同步分化，而对照组仅在牙尖区域分化明显。Col1a1染色显示基质沉积增强。Yoda1处理还显著上调了Wnt10a表达和β-catenin-pY489水平，进一步支持Piezo1在Wnt/β-catenin信号级联中的调控作用。

五、讨论与结论

该研究表明，Piezo1和Piezo2在成牙本质细胞终末分化中具有功能冗余性，单个基因敲除不引起明显表型，而双敲除则导致成牙本质细胞分化受损。Piezo通道的缺失并未完全阻止成牙本质细胞分化或牙本质形成，而是削弱了关键时间点的分化进程，可能导致成牙本质细胞发育不全。Wnt信号在dKO小鼠成牙本质细胞终末分化过程中受损，外源性Wnt10a可挽救dKO牙齿的表型，提示Piezo通道主要通过调控Wnt信号来调节成牙本质细胞分化。然而，Piezo通道是否作为Wnt信号的上游直接调控因子尚不能完全确定，也可能通过平行通路影响Wnt信号。

Piezo通道激活引起的钙离子内流可能通过钙调蛋白激活CaMKII，进而促进β-catenin核转位以调控靶基因转录。Wnt10a是前成牙本质细胞终末分化过程中的主要配体，可通过自分泌机制调控成牙本质细胞的终末分化和功能。值得注意的是，dKO小鼠的早期牙齿发育无明显表型，提示其他机械敏感通道（如TRPV4、Trek1、Pkd1/Pkd2等）可能存在部分功能冗余。由于dKO小鼠出生后早期死亡，无法进一步研究Piezo通道在出生后阶段的作用，未来需要建立能够存活至牙齿发育完成的新模型系统。

此外，成釉细胞中观察到的缺陷可能是成牙本质细胞发育受损的继发效应，因为Wnt1-Cre2不靶向口腔上皮层。使用上皮特异性Cre品系将有助于阐明Piezo通道在釉器官发育中的潜在细胞自主作用。

综上所述，研究人员通过遗传学和药理学方法证实，Piezo通道介导的信号参与成牙本质细胞发育调控。Piezo1/Piezo2基因的破坏损害了成牙本质细胞的终末分化和牙本质形成，而Piezo1通道的药理学激活则促进细胞分化和牙本质形成。Piezo通道通过调控Wnt信号通路参与成牙本质细胞分化，这些证据确立了Piezo通道在成牙本质细胞发育中的功能作用，为牙本质形成相关疾病的研究提供了新的方向。