《Chemistry & Biodiversity》：Comparative Phytochemical and Biological Evaluation of Four Thymus Species From Türkiye for Dermocosmetic Applications
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百里香属（Thymus）植物在安纳托利亚地区长期被用于伤口愈合和皮肤疾病治疗。本研究利用基于UHPLC-HRMS/MS的分子网络（molecular networking）、抗衰老酶抑制实验及细胞模型（L929成纤维细胞、HaCaT角质形成细胞、HUVEC内皮
百里香属（Thymus）植物在安纳托利亚地区长期被用于伤口愈合和皮肤疾病治疗。本研究利用基于UHPLC-HRMS/MS的分子网络（molecular networking）、抗衰老酶抑制实验及细胞模型（L929成纤维细胞、HaCaT角质形成细胞、HUVEC内皮细胞），对四种分类群——Thymus leucostomus（TL）、Thymus sipyleus（TS）、Thymus brachychilus（TB）和Thymus migricus（TM）——的代谢产物及生物活性进行了表征。所有分类群均呈现富含三萜类（triterpene）的图谱，其中TL富含多甲氧基黄酮类（polymethoxylated flavonoids），TM富含二萜类（diterpenes）。提取物对透明质酸酶（hyaluronidase）、胶原酶（collagenase）和弹性蛋白酶（elastase）表现出强抑制活性，对酪氨酸酶（tyrosinase）的抑制则较为温和；最高值记录为TB（透明质酸酶，89.64%）、TM（弹性蛋白酶，78.31%）和TL（胶原酶，82.92%；酪氨酸酶，39.74%）。在生物学方面，TL表现出最广泛的细胞相容性，并在成纤维细胞（约84.7%）和角质形成细胞（约71.3%）模型中显著促进伤口闭合。TL和TS实现了近乎完全的内皮细胞伤口闭合，提示其具有促再生潜力。TL在HaCaT和HUVEC细胞中表现出较低的细胞毒性（IC50 ≈ 0.5 mg/mL），而TM在角质形成细胞中表现出较强的细胞毒性（IC50 ≈ 0.1025 mg/mL）。TM在L929成纤维细胞中适度增加了细胞内活性氧（ROS）水平，而TL和TS使ROS水平更接近对照条件。总体而言，TL和TS在伤口闭合、氧化平衡和酶抑制方面表现出更均衡的体外特性，而TM则需要更谨慎的浓度依赖性解读。
一、研究背景与意义
皮肤衰老是时间性进程与环境因素共同作用的复杂生物学现象。在这一过程中，细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的结构完整性遭到破坏，主要介导酶包括胶原酶（collagenase）、弹性蛋白酶（elastase）、透明质酸酶（hyaluronidase）和酪氨酸酶（tyrosinase）。胶原酶降解胶原蛋白——真皮基质的主要结构蛋白——导致皱纹形成和皮肤紧致度下降；弹性蛋白酶分解弹性纤维，导致弹性丧失；透明质酸酶通过分解透明质酸引起皮肤干燥和体积流失；酪氨酸酶则是决定黑色素生物合成速率的关键酶，其过度活性与色素沉着过度和老年斑形成相关。因此，抑制这些酶的过度活性是抗衰老策略的核心方向。然而，现有抑制剂可能存在副作用、不稳定性或功效有限等问题，亟需开发新型、安全、有效的天然替代品，特别是用于化妆品领域。
百里香属（Thymus L.）隶属于唇形科（Lamiaceae），全球共有341种，土耳其分布46种，其中19种为特有种。该属植物在安纳托利亚地区被长期用于腹痛、焦虑、支气管炎、感冒、糖尿病、高血压、皮肤病等多种疾病的治疗，尤其在伤口愈合和皮肤疾病方面有悠久的民族植物学应用传统。尽管该属植物化学多样性丰富，但目前在化妆品中的应用主要局限于Thymus vulgaris L.和Thymus serpyllum L.两个物种。T. brachychilus（TB）、T. leucostomus（TL）、T. migricus（TM）和T. sipyleus（TS）这四种较少研究的物种，虽然已有独立的抗氧化和酶抑制活性研究报道，但缺乏跨物种的直接比较，且实验条件——包括提取溶剂、酶来源和参考化合物——在研究之间存在显著差异，限制了跨研究解读。值得注意的是，已有研究均未涉及与化妆品相关的靶点如胶原酶、弹性蛋白酶或透明质酸酶抑制，也未在皮肤细胞模型中评估其生物活性。
本研究旨在探索四种百里香属物种的皮肤化妆品潜力，以丰富目前化妆品配方中利用的生物资源。研究人员假设百里香提取物的代谢组学组成的种间差异与其不同的皮肤化妆品相关生物学反应相关联，特别是在细胞相容性、伤口闭合行为、氧化平衡和抗衰老酶抑制方面。这是首个将代谢组学分析与这四种百里香属物种的皮肤化妆品相关细胞和酶评价相结合的比较研究，扩展了唇形科中较少研究成员的皮肤化妆品潜力的认识。
二、主要技术方法
研究人员于2024年8月从土耳其不同地区采集了四种百里香属植物样本，凭证标本保存于Alt?nba?大学药学院标本馆。TB样本（HERA 1029）采集自Ni?de的Alada?lar山脉；TL样本（HERA 1059）采集自?orum的Bayat镇；TM样本（HERA 1166）采集自Van；TS样本（HERA 1073）采集自Sivas的Divri?i。植物地上部分阴干粉碎后，用96%乙醇按1:10比例浸提3天，旋转蒸发获得干提取物，提取率分别为TL 2.0%、TS 9.0%、TM 9.9%、TB 3.3%。研究采用UHPLC-HRMS/MS（超高效液相色谱-高分辨质谱联用）结合基于特征的分子网络（feature-based molecular networking, FBMN）进行代谢物分析，并综合GNPS、TIMA-R和SIRIUS三种注释工具进行化合物鉴定。生物学评价方面，研究人员使用MTT法测定提取物对L929小鼠成纤维细胞、HUVEC人脐静脉内皮细胞和HaCaT人角质形成细胞三种细胞系的细胞毒性并计算IC50值；采用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EtBr）双染法和PI/Annexin V双染法检测细胞凋亡与坏死；通过体外划痕实验（scratch assay）评估伤口闭合率；利用DCF-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平；并分别测定了提取物对胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶和酪氨酸酶的体外抑制活性。
三、研究结果
3.1 四种百里香属植物的植物化学分析
通过FBMN方法对四种物种的化学多样性进行探索，离子身份分子网络（IIMN）包含1006个节点，分为37个簇和37个单节点。去重复化分析聚焦于萜类化合物（簇1）和酚类化合物（簇3、5、7、15和21）等生物活性特化代谢物家族。簇1（106个节点）被推定注释为三萜类化合物，主要为乌苏烷/蒲公英甾烷型或木栓烷型（包括齐墩果酸、熊果酸、山楂酸和甘草次酸型注释），另有较小的羽扇豆烷型三萜亚组（桦木酸、桦木醇）。TL、TS和TB共享丰富多样的三萜类图谱，以齐墩果酸型衍生物为主，含少量羽扇豆烷三萜；TM的三萜总丰度最低，但二萜类特征比例较高。簇3和簇5被推定注释为多酚类化合物，TM、TS和TB的多酚图谱大致相似，以木犀草素、芹菜素和柚皮素的糖苷化衍生物为主，而TL则呈现明显不同的组成，糖苷化黄酮类含量较少，多甲氧基黄酮类注释相对丰富。簇7、15和21被推定注释为酚酸衍生物，主要为咖啡酸型，TS是咖啡酸型衍生物最丰富的物种。总体而言，四种物种共享三萜类、黄酮类、二萜类和酚酸类等主要代谢物类别，但相对分布存在显著差异。
3.2 体外酶活性
在1 mg/mL浓度下，四种提取物对透明质酸酶均表现出强抑制活性，其中TB最强（89.64 ± 4.45%），与标准品单宁酸（84.95 ± 0.76%）相当。TM在弹性蛋白酶抑制中活性最高（78.31 ± 1.80%），但与其他提取物无显著差异，均低于标准品表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，94.61 ± 0.89%）。TL的胶原酶抑制活性最高（82.92 ± 2.22%），但未显著优于其他提取物，均低于标准品EGCG（97.35 ± 2.27%）。酪氨酸酶抑制方面，TL活性最高（39.74 ± 0.55%），但所有提取物均远低于标准品曲酸（73.27 ± 1.95%），表明酪氨酸酶抑制功效有限。总体而言，四种提取物对透明质酸酶、弹性蛋白酶和胶原酶均表现出显著抑制活性，对酪氨酸酶抑制较弱，且各提取物之间的活性差异大多无统计学意义。
3.2.1 MTT实验
在L929成纤维细胞中，所有提取物的IC50值均大于0.5 mg/mL，其中TL表现出最高的细胞活力维持能力，TM在最高测试浓度（0.5 mg/mL）下表现出明显细胞毒性。在HaCaT角质形成细胞中，TM、TS和TB均降低细胞增殖，TM表现出最强的细胞毒性（IC50 ≈ 0.1025 mg/mL），而TL是唯一未抑制角质形成细胞增殖的提取物（IC50 > 0.5 mg/mL），这可能与其缺乏可检测的二萜类化合物有关。在HUVEC内皮细胞中，TB（IC50 ≈ 0.05546 mg/mL）和TM（IC50 ≈ 0.35 mg/mL）表现出细胞毒性，而TL和TS的IC50值大于0.5 mg/mL。这些结果表明百里香提取物在化妆品应用中具有潜力，但需严格控制浓度依赖性细胞毒性效应。
3.3 吖啶橙/溴化乙锭双染
在L929细胞中，TB和TL表现出相对较低的毒性（死亡细胞约30%和25%），而TS和TM表现出更明显的细胞毒性（约57%和68%），TM的细胞毒性甚至与阳性对照H2O2无显著差异。在HUVEC细胞中，TS维持了最高的细胞活力，而TL、TB和TM均显著降低细胞活力。在HaCaT细胞中，TM和TS表现出最强的细胞毒性，TL和TB毒性较低。总体而言，TB和TL在所有细胞系中表现出最低的毒性，特别是在L929细胞中。
3.4 PI/Annexin V染色
在L929成纤维细胞中，TL处理导致晚期凋亡显著升高（77.2%）同时完全抑制坏死（0%），提示其具有强效的凋亡但非坏死机制；TM则显著增加坏死（46.2%）和晚期凋亡（44.2%），表现为凋亡与膜破坏混合的细胞毒性反应。在HUVEC内皮细胞中，TB诱导最显著的晚期凋亡增加（61.8%），TM将坏死升高至20%，TL呈现均衡的早期和晚期凋亡及有限坏死的特征，与温和细胞毒性一致。在HaCaT角质形成细胞中，TS和TM引起最显著的凋亡转变，TL和TB则使细胞群体更接近对照水平。总体而言，TL一致地诱导受控的凋亡活性同时最小化坏死，表明其具有良好的生物相容性。
3.5 体外划痕实验
在L929成纤维细胞中，TL实现了最高的伤口闭合率（84.7%），TS（79.1%）和TB（77.1%）次之，而TM仅达到11.8%，与阳性对照（1.9%）相近。在HaCaT角质形成细胞中，TM实现了最高的伤口闭合率（85.7%），TS（79.7%）和TL（71.3%）次之，TB为55.7%。在HUVEC内皮细胞中，TL和TB实现了100%的完全伤口闭合，TS达到96.5%，TM为85.7%。这些结果表明，TL在成纤维细胞和内皮细胞中表现出优异的促伤口愈合活性，而TM在角质形成细胞中活性最强但在成纤维细胞中几乎无活性。
四、讨论与结论
研究结果表明，四种百里香属提取物的植物化学组成差异并未对其酶抑制活性产生决定性影响，各提取物在透明质酸酶、胶原酶和弹性蛋白酶抑制方面表现相当。然而，在细胞水平上，提取物的活性存在显著差异。TL在三种细胞系中均表现出最广泛的细胞相容性和均衡的促再生活性，同时维持了较低的ROS水平，成为最有前景的候选物种。TS同样表现出良好的伤口闭合能力和氧化平衡维持能力。TM虽然在某些酶抑制和角质形成细胞伤口闭合方面表现突出，但其较高的细胞毒性和坏死诱导效应要求更谨慎的浓度依赖性解读。TB则在酶抑制方面表现均衡，细胞毒性介于中间水平。
该研究首次将代谢组学分析与皮肤化妆品相关的细胞和酶评价相结合，对这四种较少研究的百里香属物种进行了系统比较。研究结论指出，TL和TS在伤口闭合、氧化平衡和酶抑制方面表现出更均衡的体外特性，是开发天然抗衰老和皮肤再生化妆品成分的优选候选物种。这一发现为拓展百里香属在化妆品领域的应用提供了科学依据，超越了目前主要局限于Thymus vulgaris和Thymus serpyllum的应用范围，为该属植物资源的多样化开发利用奠定了基础。
