《Chemistry & Biodiversity》：Chronic Paraquat Neurotoxicity and Dopaminergic Degeneration: A Mechanistic Review
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帕金森病（PD）是一种重要的神经退行性疾病，影响全球总人口的1%–2%。尽管其患病率较高，目前仍缺乏能够预防或逆转神经损伤的有效治疗手段。PD的临床特征包括运动迟缓、姿势不稳、震颤和强直。该疾病的病理学定义为黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的进行性退变，以
帕金森病（PD）是一种重要的神经退行性疾病，影响全球总人口的1%–2%。尽管其患病率较高，目前仍缺乏能够预防或逆转神经损伤的有效治疗手段。PD的临床特征包括运动迟缓、姿势不稳、震颤和强直。该疾病的病理学定义为黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的进行性退变，以及伴有α-突触核蛋白（寡聚体）聚集的Lewy小体病理改变，尽管Lewy小体（LB）在细胞死亡中的确切作用仍存在争议。与其他神经退行性疾病类似，PD的病因涉及遗传、环境及其他未知因素。某些神经毒素如鱼藤酮、代森锰、6-OHDA、MPTP和百草枯是导致PD的主要因素。其中，百草枯（PQ）因其在发展中国家广泛使用而与PD密切相关。许多体外和体内研究报告了接触PQ可导致PD的发生。PQ引起的细胞凋亡与氧化应激、内质网应激、多巴胺分解代谢改变、线粒体功能障碍等相关。本综述将总结关于慢性接触PQ在PD背景下的使用及影响的现有科学证据。
1 引言
帕金森病（PD）是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病，其特征为黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元的进行性严重丧失。临床表现包括运动迟缓、运动减退、静止性震颤和强直，通常在这些细胞丧失超过70%后出现。该病由James Parkinson于1817年首次描述。PD在全球不同地区发病率存在差异，但估计全球患者人数为610万，每年新增病例约102万。PD的病因涉及遗传突变、代谢缺陷和环境因素暴露等。在众多环境因素中，百草枯（PQ）作为一种广泛使用的除草剂，过去30年来一直是流行病学和毒理学研究的重点。PQ与MPTP在结构上具有相似性，可通过中性氨基酸转运体穿过血脑屏障（BBB）。在神经元内，PQ通过氧化还原循环产生超氧阴离子，引发氧化应激，尤其对多巴胺能神经元具有高度敏感性。农业健康研究（美国）表明，PD风险与接触该农药的天数成正比。尽管欧洲等地禁止使用PQ，但第三世界国家仍广泛使用。
2 PD的病理学
PD的完整发展包括运动迟缓、静止性震颤等运动症状。正常大脑黑质细胞在每个十年间以4.7%–6%的速度下降，但不足以导致PD。PD的共同特征是连接黑质（SN）和纹状体的神经通路丧失。SNpc神经元通过黑质纹状体通路为纹状体提供多巴胺能神经支配。当PD临床症状完全出现时，黑质中约80%的多巴胺能神经元已被破坏。此外，PD的其他显著病理特征包括在存活的多巴胺能神经元中形成Lewy小体（LB），这些胞质包涵体存在于大脑不同区域。
3 PD的病因学
大量证据表明PD具有多因素病因，涉及遗传突变和环境因素。遗传学研究分析了α-突触核蛋白、PINK1、Parkin、DJ-1和dardarin等基因的突变。然而，并非所有PD病例都能完全由遗传解释。许多环境因素也被认为与PD发病或进展有关，包括溶剂、一氧化碳、农药、金属等。流行病学研究显示，居住在农村、从事农业、饮用井水以及接触PQ等农业化合物与PD风险升高相关。
4 参与PD的神经毒素和农药
多种农药和神经毒素可导致PD，包括鱼藤酮、6-OHDA、MPTP、PQ、代森锰和狄氏剂。这些因素在家族性、特发性及继发性或毒素诱导的帕金森综合征中表现不同。流行病学研究表明，农业社区中毒素诱导的PD患病率较高。接触农药或除草剂可使PD发生风险增加3至4倍。
5 百草枯
PQ属于广谱联吡啶类除草剂，具有非选择性、作用迅速的特点，能干扰植物细胞内运输，破坏细胞器并导致细胞死亡。它广泛用于控制阔叶杂草和禾本科杂草。PQ可通过摄入、皮肤接触和吸入等途径导致中毒甚至死亡。PQ被认为是PD的潜在模型，因为它与MPTP的活性代谢物MPP+具有一些生化和分子相似性。在神经元内，PQ通过ROS产生、脂质过氧化、α-突触核蛋白聚集、内质网应激和多巴胺分解代谢调节等方式诱导氧化应激，最终导致多巴胺能神经元死亡。
6 PQ毒性诱导PD的机制
6.1 PQ与血脑屏障
PQ能够穿透BBB，尽管效率低且缓慢，但全身注射后可在中枢神经系统中检测到可测量量的PQ。研究表明，14C标记的PQ皮下注射Wistar雄性大鼠后，脑内PQ浓度在给药后第1小时达到峰值，随后急剧下降。PQ与内皮细胞相互作用不会导致BBB功能恶化。进入中枢神经系统后，PQ主要与嗅球前段、松果体、后区、脑室和下丘脑等结构结合。PQ存在于腹侧中脑，半衰期约为4周。有报道称PQ通过多巴胺转运体（DAT）被多巴胺能神经元摄取，但Richardson等人认为PQ不是DAT的底物，因为其无法阻断DAT介导的多巴胺摄取。PQ进入其他脑区的分子通路仍需进一步研究。
6.2 PQ诱导α-突触核蛋白病理
在大多数PD患者的SNpc多巴胺能神经元中可发现Lewy小体（LB），其主要由α-突触核蛋白聚集体构成。α-突触核蛋白是一种高度动态的内在无序蛋白，可呈现可溶性单体或螺旋多聚体形式。然而，它可以从单体构象转变为各种寡聚体和聚集形式，如原纤维和球形聚集体。α-突触核蛋白主要位于突触前末端，可能参与突触可塑性和神经递质释放。研究表明α-突触核蛋白与PQ等环境毒物相互作用，增加其聚集和寡聚化的倾向。体外研究显示PQ以剂量依赖性方式增强α-突触核蛋白的纤维化速率。PQ通过两种重要机制产生α-突触核蛋白自由基：(i) 刺激小胶质细胞中的NADPH氧化酶并激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生过氧亚硝酸盐（ONOO?）；(ii) 释放线粒体中的细胞色素c进入胞质触发过氧化物酶活性。
6.3 PQ诱导的氧化应激
6.3.1 脂质过氧化增加
脂质过氧化是氧化应激引起的破坏细胞膜、脂蛋白及其他含脂质产物的过程。由于大脑富含不饱和脂肪酸，因此更容易发生脂质过氧化。荟萃分析发现PD患者血液中丙二醛（MDA）水平升高。在PD脑组织的LB中也检测到Nε-(羧甲基)赖氨酸和4-羟基壬烯醛（HNE）等脂质过氧化终产物。PQ处理的SK-N-SH细胞中MDA水平加倍，果蝇脑内MDA水平也升高。
6.3.2 细胞内ROS水平升高
几乎所有神经退行性疾病都以氧化应激为特征。线粒体ROS产生和电子传递链（ETC）对分子氧的代谢增加使神经元对氧化应激极为敏感。在PD中，氧化应激与SNCA聚集引起的LB发展和泛素-蛋白酶体系统（UPS）功能障碍相关。PQ等神经毒素通过升高ROS、自由基和阴离子触发氧化应激机制，导致多巴胺能神经元损伤。
6.3.3 PQ与线粒体功能障碍
PQ通过抑制PD患者SNpc中线粒体复合物I的功能引起线粒体功能障碍。PQ2+接受电子变为PQ+，干扰NAD(P)H氧化和复合物I的作用。PQ+与氧气反应产生超氧自由基（O2?.），然后氧化回PQ2+，形成反复的氧化还原循环。O2?.引发级联反应产生H2O2和羟基自由基（OH?）。这导致线粒体功能障碍和多巴胺能神经元细胞死亡。然而，一些报道显示PQ暴露后未抑制复合物I，表明复合物I可能不是关键靶点。但PQ通过抑制复合物I引起多巴胺能神经元死亡仍是基本现象。研究还发现PQ在ETC复合物III中产生ROS。参与PQ生物活化和代谢的关键酶包括细胞色素P450、一氧化氮合酶（NOS）、硫氧还蛋白还原酶和NADPH氧化酶（NOX）。
6.3.4 Nrf2-Keap1-ARE信号通路下调
Nrf2是一种主要转录因子，调节多种抗氧化防御途径。正常情况下，胞质中的Nrf2被UPS迅速降解，当Nrf2与Keap1结合时发生降解。氧化应激阻断Keap1介导的Nrf2降解，导致Nrf2转运至细胞核并积累。研究表明PQ引发的氧化应激可刺激Nrf2-Keap1-ARE通路，促进下游抗氧化反应化合物如HO-1 mRNA和NQO1的产生。
6.3.5 抗氧化防御受损
谷胱甘肽（GSH）是体内重要的系统性抗氧化剂。但PD患者SNpc中GSH水平降低，血液中还原型GSH也减少。GSH降低会损害细胞的抗氧化防御机制。GSH耗竭可能与产生GSH的限速酶谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）活性下降有关。表3列出了PQ暴露与抗氧化酶减少的相关研究。此外，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等其他抗氧化酶也参与防御。PQ通过降低抗氧化防御引起氧化损伤。
6.3.6 百草枯与亚硝化应激
一氧化氮和O2?.快速反应生成ONOO?，进而导致活性氮（RNS）产生。ONOO?可将─NO2基团转移至蛋白质中的酪氨酸残基，导致蛋白质结构改变和多巴胺能神经元死亡。3-硝基酪氨酸是氧化和亚硝化应激的标志物。PD早期患者血清和脑脊液中检测到大量3-硝基酪氨酸和硝基白蛋白。在GCL敲除小鼠中，PQ显著增加3-硝基酪氨酸水平。PQ还使果蝇脑内ONOO?浓度升高2.6倍。因此，氧化应激和亚硝化应激是百草枯诱导神经毒性的两大主要原因。
6.4 PQ与内质网应激
内质网完整性破坏导致未正确折叠蛋白引发的内质网应激。应激产生的ROS和炎症因子可能干扰Wnt/β-catenin和LXR等调节通路。研究发现PQ可干扰正常海马结构，损害神经信号传递和海马记忆认知功能。PQ可通过影响海马神经元中雌激素受体表达抑制雌激素信号传导，扰乱内质网活性，导致海马神经元死亡。成年小鼠暴露于20 mg/kg PQ可杀死SGZ和SVZ两种神经干细胞，同时这些干细胞中IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子等炎症因子增加。这些炎症因子通常在小胶质细胞内质网应激反应后产生，表明PQ可引起神经炎症。
6.5 PQ与持久多巴胺溢出及多巴胺产生减少
NMDA受体介导的兴奋性毒性是PD中DA神经元丧失进展的关键因素之一。PQ体内实验表明PQ激活谷氨酸释放，通过RNS引发兴奋性毒性。一氧化氮合酶（NOS）表达神经元被激活，NMDA受体通道去极化允许Ca2+进入。细胞外谷氨酸的增加呈PQ剂量依赖性。Ca2+内流激活Ca2+依赖性细胞内过程，包括神经元NOS的刺激。NOS产生的NO扩散至多巴胺能神经元末端，与PQ氧化还原循环产生的O2?.反应形成过氧亚硝酸盐（ONOO?）。ONOO?可氧化蛋白质、脂质、DNA和RNA，抑制锰超氧化物歧化酶活性，抑制线粒体ETC，导致ATP产生减少，并断裂DNA链。谷氨酸受体拮抗剂、NOS抑制剂和单胺氧化酶抑制剂（L-deprenyl）可阻断长期多巴胺释放和随后的多巴胺能神经元死亡，证明慢性低剂量PQ暴露通过兴奋毒性途径增加黑质纹状体多巴胺系统神经元的易感性。PC12细胞模型研究表明酪氨酸羟化酶（TH）在ONOO?暴露后被优先硝化，导致酶活性丧失和DA水平下降。
6.6 PQ与DA代谢紊乱及神经毒性
PQ通过多种途径干扰DA代谢引起神经毒性。它可降低多巴胺主要代谢物高香草酸（HVA）、DOPAC和3-甲氧酪胺（3-MT）的水平及其比率。PQ•+作为DAT底物，在微胶质细胞中由NADPH氧化酶还原PQ2+生成PQ•+。PQ•+在多巴胺能神经元中积累产生氧化应激和细胞毒性。除了DAT，PQ•+还是有机阳离子转运体3（Oct3）的底物。PQ还通过刺激酪氨酸羟化酶和抑制单胺氧化酶（MAO）提高胞质DA水平，导致多巴胺积聚和有毒醌蛋白的形成。此外，PQ降低VMAT2表达，损害多巴胺囊泡隔离，增加胞质多巴胺浓度。尽管TH活性增加，儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）水平无变化。高水平的胞质DA扰乱DA代谢，增加DA氧化和ROS生成的风险。PQ与多巴胺联合引起ROS大幅升高。
6.7 PQ与神经炎症
神经炎症是大脑中重要的防御机制，主要由星形胶质细胞和小胶质细胞介导。然而，在遗传因素或环境毒素（如农药）慢性刺激下，这种保护性反应转变为促炎状态，刺激神经毒性和神经元渐进性退变。PQ暴露在啮齿动物模型的额叶皮层、SN和海马中引起严重神经炎症反应，以TNF-α和IL-1β等促炎因子升高为特征。在BV2小胶质细胞中，PQ暴露导致形态学激活表型、IL-1β mRNA和TNF-α升高，并增强TLR4表达。PQ两次给药可显著激活SNpc中的小胶质细胞并随时间进展，导致多巴胺能神经元凋亡。星形胶质细胞也是PQ诱导神经炎症的主要参与者。低剂量PQ诱导延迟性小胶质细胞激活，先于星形胶质增生。即使在去除PQ后星形胶质细胞激活仍持续，暴露后20天小胶质细胞激活显著增加，TNFα水平仍升高，表明农药清除后慢性小胶质功能障碍可持续驱动神经炎症。
6.8 PQ与基因和蛋白质的改变
PQ增强炎症基因表达并抑制抗炎基因表达。铁蛋白基因表达差异和腹侧中脑TH阳性神经元染色丧失可能导致PQ神经毒性的遗传易感性差异。PQ通过调节固有免疫应答基因（如刺激转录因子NF-kβ和JNK信号因子）导致氧化应激和神经变性。它还可抑制Toll和IMD通路中抗菌肽的产生，增加细菌感染风险。干扰素γ（IFNγ）可影响PQ诱导的PD，敲除IFN-γ基因可减少PQ刺激的炎症和神经毒性效应。
6.9 凋亡信号通路的激活
细胞凋亡是PD中神经元死亡的主要机制。凋亡由半胱天冬酶（caspase）的蛋白水解级联触发。凋亡性半胱天冬酶分为起始型（caspase-8,9）和效应型（caspase 3,6,7）。BCL-2家族蛋白通过直接物理相互作用调节线粒体外膜透化（MOMP）。该家族分为抗凋亡蛋白（BCL-2、MCL-1、BCL-XL）、促凋亡成孔蛋白（BAK和BAX）以及仅BH3促凋亡蛋白（Noxa、BAD、BNIP3等）。当细胞进入凋亡时，仅BH3蛋白附着于线粒体外膜，增强BAK和BAX的结合亲和力，导致其寡聚化并插入线粒体双层形成MOMP。随后释放细胞色素c、Smac/DIABLO等促凋亡蛋白进入胞质，招募并激活半胱天冬酶。PQ暴露通过ROS和RNS激活凋亡。PQ神经毒性通过BAK依赖性通路介导，涉及上游的仅BH3蛋白BNIP3和Noxa。SK-NSH细胞经PQ处理后BAK、BNIP3和Noxa的mRNA和蛋白表达上调，细胞色素c和裂解的caspase-3水平升高。此外，PQ还释放HtrA2/Omi和Smac/DIABLO等其他促凋亡蛋白。
7 PQ和代森锰的协同毒性
在农业生产中多种农药常同时使用。PQ和代森锰是作物生产中常用的农药。在低剂量PQ+代森锰给药的小鼠模型中，由于纹状体DAT和HT蛋白水平下降，出现运动缺陷，并伴有神经元的丧失和反应性胶质增生。预先暴露于代森锰、PQ或两者的小鼠，单次给予MPTP（15 mg/kg）会增强黑质纹状体系统的易感性。在表达A30P+A53T双突变α-突触核蛋白的小鼠中，PQ+代森锰暴露导致多巴胺水平急剧下降。尽管α-突触核蛋白聚集并非在所有PD模型中都观察到，但PQ和代森锰处理的小鼠mTOR升高、自噬流减少，HSC70和HSP-70/90上调，提示自噬失败。α-突触核蛋白自由基形成可能是PQ+代森锰暴露小鼠神经元中该蛋白聚集的起始步骤。
8 结论
本综述揭示了PQ与PD之间的关联，PQ通过诱导氧化应激导致ROS产生。现有数据表明，PQ通过多种相关病理途径而非单一机制引起多巴胺能神经元损伤。这些生化途径包括氧化损伤、内质网应激、TH失活或抑制、线粒体功能障碍、多巴胺分解代谢改变以及神经营养因子BDNF减少，最终导致SNpc多巴胺能神经元死亡。这些机制途径相互放大，形成细胞应激和神经元易损性的恶性循环。PQ可能通过影响氧化还原平衡、线粒体功能、蛋白质聚集和神经元存活途径驱动帕金森病病理。因此，PQ的模型（in silico、in vitro和in vivo）在增强氧化应激状态下直接或间接参与PD发病机制，可为未来建立创新治疗方法提供广阔前景。将百草枯视为“农药相关性帕金森综合征和帕金森样神经退变”综合征的一部分更为恰当，而非特发性PD的确切病因。
9 当前挑战和未来展望
实验室动物模型和生化理论提供了PQ暴露后发展为PD风险升高的证据，但环境背景应在实验室中进一步研究。建议扩展实验室研究以反映环境背景，并测试包括捕获的野生动物和农场动物在内的动物模型，这些动物已在环境中暴露于PQ，同时进行人群研究。此外，需要以人群为基础的研究策略，结合遗传学、表型表达和生态毒理学，预期PD表型表达的区域差异，并考虑文化差异（如PPE佩戴安全标准的差异）。了解通过各种途径的PQ暴露程度、速率和浓度将增强对这一难题的实验研究。
