来自Melipona beecheii蜂胶的五环三萜及其半合成衍生物的抗氧化活性

《Chemistry & Biodiversity》：Antioxidant Activities of Pentacyclic Triterpenes From Melipona beecheii Propolis and Their Semisynthetic Derivatives

　　

从Melipona beecheii蜂胶中获得四个主要馏分（I–IV）。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析这些馏分使研究人员识别出11种五环三萜（PTs）：馏分I[β-香树脂醇乙酸酯（β-amyrin acetate, 1）、日耳曼醇乙酸酯（germanicol acetate, 2）、moretenol acetate（3）和24-亚甲基环阿屯-3-醇乙酸酯（24-methylencycloartan-3-ol acetate, 4）]；馏分II[marsformosanone（5）、β-香树脂酮（β-amyrenone, 6）、日耳曼酮（germanicone, 7）和羽扇豆酮（lupenone, 8）]；馏分III[β-香树脂醇（β-amyrin, 9）和粘霉醇（glutinol, 10）]；馏分IV[9和α-香树脂醇（α-amyrin, 11）]。这是首次在M. beecheii蜂胶中报道三萜7和10。制备了三种半合成衍生物：馏分II的还原以及馏分IV的乙酰化和氧化。在使用10 mg/mL浓度时，蜂胶乙醇提取物和馏分III表现出最高的游离DPPH自由基清除能力，分别为53.89 ± 8.39%和47.77 ± 0.91%。相反，Fe(III)还原力分析显示所有馏分及其衍生物均具有强的Fe(III)还原力，EC₅₀ = 0.8–1.0 mg/mL。

氧化应激是活性氧（ROS）与内源性抗氧化防御失衡所致，与慢性炎症、代谢障碍、神经退行性疾病和感染性疾病相关。因此，天然来源的外源性抗氧化剂备受关注。蜂产品（蜂蜜、花粉、蜂胶）是抗氧化分子的重要来源，其中无刺蜂蜂胶作为热带地区的增值产品引起研究兴趣。Melipona beecheii是一种广泛分布于中美洲和墨西哥南部的无刺蜂，其蜂胶具有多种生物活性，但其抗氧化潜力尚未被严格表征，且少有研究将抗氧化能力与化学谱直接关联。已有报道该蜂胶的亲脂性部分富含五环三萜（PTs），包括乌苏烷、齐墩果烷、弗里德兰烷和羽扇烷类型。PTs可调节与氧化应激相关的生理过程，并具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物活性。化学衍生化研究进一步体现了该代谢物家族的多样性和药理学相关性。因此，本研究旨在评价M. beecheii蜂胶亲脂性部分中的11种主要PTs及其半合成衍生物，以确定化学修饰如何影响其体外抗氧化活性。该研究发表于《Chemistry》期刊。

研究人员首先将M. beecheii蜂胶乙醇提取物（EEP）经正己烷分配得到正己烷馏分（HFP），再经柱色谱分离得到四个主要馏分（I–IV）。通过GC-MS和¹H-NMR鉴定了11种PTs，根据C-3官能团分类：I为乙酸酯类，II为酮类，III和IV为羟基类。其中日耳曼酮（7）和粘霉醇（10）首次在该种蜂胶中被报道。随后对馏分II进行NaBH₄还原获得还原衍生物IIa，对馏分IV进行乙酰化和PCC氧化分别获得IVa和IVb。采用DPPH自由基清除法和Fe(III)还原力法评估所有样品的体外抗氧化活性。

主要技术方法包括：（1）样品采集：蜂胶采集自墨西哥尤卡坦州Maní的两个蜂场（“Flor de Mayo”和“u Náajil Yum Kin”），共789 g；（2）提取分离：乙醇浸提获EEP，正己烷分配获HFP，硅胶柱层析分离得到I–IV；（3）结构鉴定：GC-MS结合NIST05质谱库和¹H-NMR（400 MHz）；（4）衍生化反应：NaBH₄还原、乙酸酐/吡啶乙酰化、PCC氧化；（5）抗氧化测定：DPPH自由基清除（517 nm吸光度）和Fe(III)还原力（700 nm吸光度），计算EC₅₀。

研究结果如下：

2.1 五环三萜的鉴定与衍生化：通过GC-MS分析馏分I–IV，依据分子离子和碎片离子鉴定出11种PTs。其中，germanicone（7）的分子离子m/z 424，提示C₃₀H₄₈O，其特征碎片m/z 205、204、189和177支持Δ18齐墩果烷结构；glutinol（10）的分子离子m/z 426（C₃₀H₅₀O），m/z 274和259来自B环的逆Diels-Alder重排。¹H-NMR进一步确认各馏分的官能团特征，如I中乙酸酯甲基δ 2.04和H-3 δ 4.48，II中酮基α-H δ 2.42，III和IV中羟基H-3 δ 3.20–3.38。衍生化反应通过NMR验证：IIa出现新羟基H-3 δ 3.23，IVa出现乙酸酯甲基δ 2.06/2.07和H-3位移至4.52，IVb出现酮基α-H δ 2.48。这些结果说明鉴定和衍生化成功。

2.2 抗氧化活性：DPPH测定显示，EEP和III的清除率最高（10 mg/mL时分别为53.89%和47.77%），但所有样品的DPPH EC₅₀值较高（9–25 mg/mL），表明自由基清除能力中等至低。Fe(III)还原力测定显示，所有馏分及衍生物的EC₅₀为0.08–1.0 mg/mL，其中EEP和HFP最低（0.08和0.1 mg/mL），而馏分II和IV较高（0.9和1.0 mg/mL）。值得注意的是，IIa的EC₅₀从0.9降至0.18，IVb的DPPH清除率最高（83.97%），说明C-3官能团修饰显著改变抗氧化行为。结果提示PTs的抗氧化机制以电子转移为主，而非氢原子转移。

总结讨论：研究人员指出，PTs尽管主要是脂肪族分子，但C-3位羟基、羰基或乙酰基可影响极性、氢键能力和α-C-H键反应性。Fe(III)还原力强而DPPH活性弱，表明这些样品的抗氧化活性主要来自电子转移过程。C-3羰基可能改变三萜骨架的电子分布，从而影响还原力。衍生化结果也支持这一点：将酮还原为羟基（IIa）降低了EC₅₀，而氧化为酮（IVb）增强了DPPH清除效率，表明作用依赖于具体的三萜骨架和官能团。然而，由于PTs未被分离为单一化合物进行测试，该构效关系应视为初步结论。局限性在于仅使用化学测定，无细胞或生物模型验证，不能外推至体内效应。

研究结论：本研究表征了来自尤卡坦的M. beecheii蜂胶的PTs谱，并在化学衍生化前后评价了其体外抗氧化活性。共鉴定出11种PTs，主要属于乌苏烷、齐墩果烷、羽扇烷、环阿屯烷和谷氨烷骨架。其中germanicone（7）和glutinol（10）为首次报道。该结构多样性反映了M. beecheii蜂胶的化学分类学丰富性，并支持其生物技术应用价值。根据C-3官能团（乙酸酯、酮、醇）对PTs进行分类，为体外抗氧化响应提供了初步构效框架。抗氧化测定显示，样品具有中等至低的DPPH自由基清除活性，但