《Molecular Psychiatry》：Corticotropin-releasing hormone neurons in the bed nucleus of the stria terminalis control wakefulness in physiological and stressful conditions in mice
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摘要
应激性和情绪显著性刺激常诱发觉醒水平增高，这种状态可易化失眠等睡眠障碍的发生。终纹床核（bed nucleus of the stria terminalis，BNST）作为情绪信息处理与焦虑相关行为的中枢，含有多种富含神经肽的神经元亚群，这些亚群可能
摘要
应激性和情绪显著性刺激常诱发觉醒水平增高，这种状态可易化失眠等睡眠障碍的发生。终纹床核（bed nucleus of the stria terminalis，BNST）作为情绪信息处理与焦虑相关行为的中枢，含有多种富含神经肽的神经元亚群，这些亚群可能响应并驱动相反的情绪状态。尽管近期研究提示BNST参与觉醒调控，但其神经元亚群控制睡眠-觉醒状态的具体机制尚不清楚。本研究表明，在雄性小鼠中，光遗传学激活BNST中表达促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）的神经元（而非表达胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）或生长抑素（somatostatin，SST）的神经元）可触发从非快速眼动（non-rapid eye movement，NREM）睡眠到觉醒的快速转换。BNST CRH神经元在觉醒和快速眼动（rapid eye movement，REM）睡眠期间均呈现活跃状态，其光遗传学激活也能从REM睡眠触发觉醒。化学遗传学激活BNST CRH神经元可显著增加觉醒量及觉醒期脑电α（8–13 Hz）频段功率，而抑制这些神经元则可减少觉醒。此外，抑制BNST CRH神经元可缓解应激诱导的觉醒增高。上述结果将BNST CRH神经元确定为生理和应激条件下觉醒的关键调控者，并提示其可能作为应激诱导的觉醒增高及失眠的潜在干预靶点。
论文解读：终纹床核CRH神经元在生理与应激条件下调控觉醒的机制研究
一、研究背景与科学问题
睡眠-觉醒周期的基础动态由昼夜节律和稳态压力共同设定，但情感性输入可打破这一平衡。在急性应激条件下，快速睡眠-觉醒转换、觉醒持续时间延长以及唤醒水平升高有助于适应性行为反应；然而，慢性应激暴露可诱发适应不良性改变，促进焦虑、成瘾和社会功能障碍等精神疾病的发生。这些应激相关精神疾病常伴有睡眠紊乱，尤其是失眠。无论是负性还是正性情绪显著性刺激，均可通过增加觉醒来影响睡眠-觉醒动态。然而，情绪系统作用于睡眠-觉醒调节环路的潜在神经机制至今仍未阐明。
终纹床核（BNST）是延伸杏仁核内的边缘前脑核团，是连接应激与奖赏相关神经系统的关键节点，对应激高度敏感，并在焦虑样行为、持续威胁监测、回避行为、奖赏与厌恶处理、社会偏好以及成瘾的戒断和复吸阶段中发挥重要作用。近期证据表明BNST是睡眠-觉醒环路中的重要促觉醒节点：光遗传学刺激BNST GABA能神经元可从非快速眼动（NREM）睡眠驱动觉醒，但在快速眼动（REM）睡眠期间的研究结果存在矛盾。BNST神经元约86%为GABA能，其余为谷氨酸能，并可依据神经肽和分子标记物分为多个不重叠亚群，包括表达促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、胆囊收缩素（CCK）、生长抑素（SST）、神经降压素、蛋白激酶Cδ、钙视网膜蛋白等。以往研究显示BNST CRH、CCK和SST富集群体代表不同的GABA能亚型，其激活与焦虑样行为增高相关；CRH和CCK神经元对情绪效价刺激表现出不同反应，SST神经元激活与恐惧记忆增强有关。然而，这些BNST GABA能神经元亚群在生理和情绪状态下对睡眠-觉醒调节的贡献仍不清楚。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员采用多种前沿技术手段系统探究了BNST CRH、CCK和SST神经元在睡眠-觉醒调控中的作用。首先，利用CRH-Cre、CCK-Cre和SST-Cre转基因小鼠，通过立体定位注射表达光敏感离子通道ChR2的重组腺相关病毒（AAV），结合脑电/肌电（EEG/EMG）记录，进行急性与慢性光遗传学激活实验。其次，采用光纤光度测定技术记录表达GCaMP6m的BNST神经元群体在自然睡眠-觉醒周期中的钙活动动态。再次，运用化学遗传学方法，在BNST CRH神经元中表达激活型hM3Dq或抑制型hM4Di受体，通过腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO）实现神经元功能增强或抑制，并结合EEG/EMG记录评估睡眠-觉醒参数及脑电频谱变化。此外，研究人员还建立了三种急性应激范式（强迫游泳、换笼挑战、捕食者气味暴露），结合CRH神经元抑制，评估其在应激诱导觉醒增高中的作用。研究使用了雄性和部分雌性小鼠（n=8用于化学遗传激活实验），小鼠来自CRH-Cre、CCK-Cre和SST-Cre品系（分别由华南农业大学、复旦大学提供），并在上海模式动物中心饲养繁殖。
三、研究结果
1. 光遗传学激活BNST CRH神经元诱导并维持觉醒
在CRH-Cre、CCK-Cre和SST-Cre小鼠的BNST双侧注射AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry并植入光纤，急性光刺激（5 ms脉冲，5–30 Hz，30 s）在NREM睡眠期进行。结果显示，蓝光（473 nm）而非黄光（576 nm）刺激可显著缩短CRH-Cre小鼠的NREM-觉醒潜伏期（30 Hz时约2.51 s），增加NREM-觉醒转换概率（30 Hz时达100%），并延长觉醒持续时间（30 Hz时约107.6 s）；而在CCK-Cre和SST-Cre小鼠中未观察到类似效应。慢性光刺激（30 Hz，40 s开/20 s关，1 h）在CRH-Cre小鼠中将觉醒时间增加204.64%，而CCK和SST小鼠无显著变化。这表明BNST CRH神经元是启动和维持觉醒的关键GABA能亚群。
2. BNST CRH神经元在觉醒和REM睡眠期间活动增高
通过光纤光度法记录GCaMP6m信号，发现BNST CRH神经元在觉醒期钙信号最高（ΔF/F=3.27±1.21%），REM睡眠期次之（2.43±1.27%），NREM睡眠期最低（-2.01±0.64%）。活动在觉醒向NREM转换前降低，在NREM向觉醒及NREM向REM转换前升高。相比之下，BNST CCK和SST神经元仅在REM睡眠期活动高，觉醒和NREM期活动低，且未在NREM-觉醒转换中显示活动升高。这提示觉醒与REM双期激活是CRH神经元特异性特征。
3. 光遗传学激活BNST CRH神经元驱动REM-觉醒转换
在稳定REM睡眠期给予光刺激，30 Hz蓝光可快速诱导CRH-Cre小鼠从REM睡眠转为觉醒，觉醒转换概率达93.45%，潜伏期缩短至约14.04 s；黄光对照无效。在CCK-Cre和SST-Cre小鼠中，各频率蓝光均未诱导REM-觉醒转换。说明BNST CRH神经元可有效驱动REM睡眠期的觉醒。
4. 化学遗传学激活BNST CRH神经元诱导觉醒增高并加深NREM睡眠
在CRH-Cre小鼠BNST表达hM3Dq，腹腔注射CNO后，3 h内觉醒量增加158.44%，NREM和REM睡眠分别减少72.24%和81.64%。脑电频谱分析显示，觉醒期α功率（8–13 Hz）显著升高，高δ功率（2–4 Hz）下降，提示唤醒水平增高；后续NREM睡眠期高δ功率升高、α功率降低，提示睡眠加深。雌性小鼠结果与雄性一致。
5. 化学遗传学抑制BNST CRH神经元减少生理条件下的觉醒
在CRH-Cre小鼠BNST表达hM4Di，于21:00注射CNO后，3 h内觉醒量从147.90 min降至104.9 min，NREM睡眠从30.87 min增至70.94 min，REM睡眠从1.25 min增至4.13 min；NREM睡眠的EEG功率谱未改变，提示增加的NREM睡眠保持正常生理特征。
6. BNST CRH神经元调节急性应激诱导的觉醒增高
在强迫游泳、换笼挑战和捕食者气味（2MT）三种急性应激模型中，预先抑制BNST CRH神经元可显著减少应激期觉醒时间百分比（FS：79.10%降至58.69%；CC：75.04%降至55.05%；2MT：75.41%降至41.64%），缩短觉醒至NREM睡眠的潜伏期，并降低觉醒期α功率、提高高δ功率，表明应激诱导的觉醒增高得到缓解。
四、讨论与结论
研究人员在讨论中指出，BNST CRH神经元而非CCK或SST神经元在NREM和REM睡眠中均具有促觉醒作用。以往关于BNST GABA能神经元在REM睡眠期激活效应不一致可能源于病毒注射的解剖位置差异：Li等人靶向更前端的BNST区域（+1.4 mm AP），该区域CRH神经元密度更高；而Kodani等人靶向更后端（+0.2 mm AP），可能招募了其他功能不同的GABA能亚群。BNST接受来自丘脑室旁核（PVT）的密集兴奋性输入，PVT-BNST CRH通路可能是PVT促进觉醒的重要下游机制。此外，激活BNST CRH神经元引起的α功率升高和高δ功率降低与人类失眠及高焦虑/应激状态下的脑电特征相似，提示其可能作为应激相关觉醒增高和失眠的治疗靶点。
研究结论：BNST CRH神经元在生理和应激条件下均参与觉醒控制。激活这些神经元可促进NREM和REM睡眠向觉醒的转换，延长觉醒时间并提高唤醒水平（表现为α功率升高和高δ功率降低）；抑制BNST CRH神经元则在生理条件下减少觉醒，并缓解应激诱导的觉醒增高。BNST CRH神经元可能成为应激相关唤醒和失眠的潜在治疗靶点。
