跨器官细胞活动成像揭示全身性环路

《Nature》：Imaging cellular activity across all organs reveals body-wide circuits

　　

： 动物的生存与繁衍能力——无论是逃避危险、进食还是抵抗感染——源于全身多种相互作用的细胞类型在瞬间的集体活动。生理学旨在阐明这些跨越器官、细胞类型和时间尺度的细胞相互作用，但一直受限于无法同时记录整个体内这种随时间变化的细胞活动。研究人员开发了WHOLISTIC（全身活体成像系统，用于记录组织和细胞内活动，WHole-Organism Live-Imaging System for recording Tissue and IntraCellular activity），一种能够在细胞分辨率下对完整脊椎动物体内秒级时间尺度的细胞活动进行成像的方法。WHOLISTIC推进并整合了体积荧光显微术、机器学习以及钙传感器（calcium sensors）的全细胞转基因表达，在幼年斑马鱼（larval zebrafish）中得到验证，并在成年丹尼奥鱼（Danionella cerebrum）中进行了概念验证。为获取所测动态的分子和超微结构底物信息，研究人员推进了全身扩张显微术（whole-body expansion microscopy, WB-ExM）。在细胞尺度上，全身筛选揭示了意想不到的反应，包括软骨细胞对寒冷的反应以及脑膜细胞对氯胺酮的反应。在器官尺度上，WHOLISTIC识别出沿肾单位传播的节律性行波。在多器官尺度上，它揭示了未知的肌肉协同作用以及肌肉-器官相互作用。在整体生物体尺度上，该方法捕获了脑干控制的全身血流再分布。将光遗传学与WHOLISTIC相结合，实现了脑-体相互作用的全光学因果解析。这些进展为系统生物学建立了一种新范式，弥合了细胞生理学与机体生理学之间的鸿沟，实现了从基本机制到治疗靶点的跨尺度全面发现。

论文解读

一、研究背景与科学问题

生命体的正常运转依赖于全身各器官、各细胞类型之间持续而精密的协调。无论是逃避危险、进食还是抵抗感染，动物的生存能力都源于全身多种细胞在瞬间的集体活动。生理学的核心目标之一便是阐明这些跨越器官、细胞类型和时间尺度的动态相互作用。然而，传统研究方法长期受限于一个根本性技术瓶颈：无法在细胞分辨率下同时记录完整活体脊椎动物体内随时间变化的细胞活动。尽管神经科学领域已通过钙成像技术实现了对大量神经元活动的同步记录，但体内绝大多数非神经细胞类型的动态活动模式从未被系统记录。对于大多数脊椎动物模型而言，光学通路受限和组织的不可透性构成了全身成像的难以逾越的障碍。透明脊椎动物，如幼年斑马鱼和成年丹尼奥鱼，凭借其先天透明性成为研究体内跨器官细胞动态的独特模型。基于此，研究人员开发了WHOLISTIC平台，旨在实现透明脊椎动物全身几乎所有细胞的钙动力学活体成像，并整合分子与超微结构层面的信息，从而系统揭示机体层面的调控环路。

二、主要技术方法

研究人员构建了在泛细胞启动子ubiquitin控制下表达遗传编码钙指示剂GCaMP7f的转基因斑马鱼品系Tg(ubi:tTA; TRE:GCaMP7f)，采用二元表达系统tTA–TRE增强传感器浓度，实现广泛而持续的泛细胞表达。成像方面，研究团队评估多种显微技术后选用转盘共聚焦显微镜，因其对组织散射和衍射具有最强的鲁棒性。针对身体运动导致的细胞位移，研究人员开发了基于迭代光流估计的配准算法，结合平滑正则化、信噪比加权梯度和多分辨率配准实现组织对齐。细胞分割采用基于约束非负矩阵分解的Voluseg方法，并利用基于相干性的谱聚类识别功能性组织集合。此外，研究人员开发了无酶、快速且稳健的全身扩张显微术WB-ExM，结合免疫荧光、原位杂交和总蛋白染色实现亚细胞分辨率的全身分子解剖，并开发PhotoMap方法定量评估扩张均匀性。光遗传学实验中使用了在运动迷走神经中表达channelrhodopsin的转基因品系以及表达抑制性光敏蛋白gtACR2的全神经元品系。

三、研究结果

1. 1.
   全身细胞钙成像

研究人员通过泛细胞转基因品系实现了幼年斑马鱼全身几乎所有细胞的钙活动成像。尽管泛细胞标记导致细胞密集排列，但不同器官和组织类型可通过细胞大小、形态、亚细胞结构、基线钙水平和传感器表达水平的差异所产生的独特视觉纹理加以区分，包括肌肉、肝脏、肾脏、脑和肠道，以及松果体和内分泌胰腺等较小细胞群。研究发现即使在静息状态下，大多数细胞也表现出可测量的、随时间变化的钙动力学，这一现象此前从未被证明。基于相干性的谱聚类分析显示，聚类结果主要对应单个组织类型的亚区域，如肾脏、胆囊、肝脏、肠道和肌肉，研究人员将其命名为功能性组织集合。以原肾肾单位为例，WHOLISTIC工作流程将其分割为连续的功能性组织集合，每个集合表现出不同的动力学特征，并共同耦合成以爆发形式发生的行波，提示肾小球滤过和腔内流动可能在更短时间尺度上呈间歇性和搏动性。

1. 2.
   骨骼肌的全身协调

研究人员通过层次聚类分析骨骼肌功能性组织集合，识别出主要的轴上肌和轴下肌躯干肌肉，它们表现出相关的活动模式，表明同步收缩的倾向。更令人意外的是，轴上肌的前背侧部分形成一个独特的功能性组织集合，即颈段轴上肌，其钙活动与腹肌相关，这一发现此前未见报道。通过Tg(VAChTa:eGFP)转基因品系追踪运动神经束，研究人员发现脊神经主要支配大部分轴上肌和轴下肌，而脊枕神经除了已知支配腹侧胸舌骨肌和胸鳍肌外，还向背侧延伸轴突支配轴上肌的颈段部分。这种双重支配支持了区域独立激活的机制。

1. 3.
   肌肉耦联动力学

研究人员通过拟合滞后回归模型研究骨骼肌活动对全身其他组织细胞钙信号的急性影响。模型揭示了多种组织对运动活动的响应，包括脑、皮肤上皮、脊索鞘细胞和鳃，且表现出组织特异性的响应特征，持续时间常超过肌肉活动本身的时间尺度。在脑内，后脑和脊髓中线的一群细胞对肌肉活动表现出显著延长的响应，持续时间约15秒。基于解剖位置和形态学特征，研究人员假设这些是室管膜细胞。通过构建室管膜细胞特异性转基因品系Tg(foxj1a:GCaMP7f)与新的泛细胞红色钙传感器品系Tg(ubi:tTA;TRE:jRGECO1b)杂交，研究人员证实室管膜细胞在运动活动后出现钙瞬变，且响应幅度与运动事件强度成比例，表明室管膜细胞将身体运动整合到其细胞状态中。

1. 4.
   脑-体耦合的光遗传学验证

将平滑肌集合纳入滞后回归模型后，模型捕获了尾侧后脑与胃咽括约肌平滑肌之间的关系，该区域对应运动迷走神经核。研究人员将表达channelrhodopsin的转基因品系与泛细胞钙指示剂品系杂交，发现激活运动迷走神经最尾侧段可诱导胃括约肌产生剂量依赖的钙激活。对整个运动迷走神经的连续激活揭示了运动迷走神经与沿前后轴分布的脏器组织之间的拓扑映射，前部运动迷走神经元控制更前部的咽部肌肉。WB-ExM显示运动迷走神经轴突在前肠水平存在显著的神经支配密度下降，为功能发现提供了解剖学基础。

1. 5.
   运动静止期的超慢振荡

研究人员分析了长时间肌肉静止期（超过10分钟）与正常运动期相比细胞钙活动的差异，发现后脑和脊髓中线区域在静止期表现出高振幅的超慢振荡活动，周期为3-7分钟。神经元和星形胶质细胞特异性品系均未恢复此类动力学，提示可能来源于室管膜细胞。通过WB-ExM-IF，研究人员发现后脑室管膜细胞并非传统认为的小立方体细胞，而是延伸出长约120微米的腹侧突起，形成沿后脑整个中线延伸至脑底的片状结构。细胞类型特异性成像证实了室管膜细胞是超慢振荡的来源。交叉相干性分析揭示了沿鱼体前后轴传播的局部波，形成约75微米长度尺度的块状结构，表明室管膜细胞通过间隙连接形成相互连接的跨脑和脊髓网络。

1. 6.
   低氧应激的脑-体响应

研究人员将动物交替暴露于常氧（21% O₂）和低氧（10% O₂）环境，计算氧调节评分。胃肠道组织在低氧期间表现出系统性基线钙水平升高。研究人员注意到肠系膜动脉在低氧期间出现收缩，通过Tg(flk1:dsRED-CAAX)品系确认了肠系膜动脉的收缩，并通过Tg(gata1:dsRED)品系发现低氧条件下肠道血流几乎完全停止，而脑和肌肉的血流基本不变。使用麻醉剂三卡因抑制神经系统后，低氧期间内脏血流不再减少，表明该过程由神经元介导。光遗传学抑制后脑在数秒内恢复肠道血流，证实后脑活动是低氧期间肠系膜动脉收缩的必要条件。此外，研究人员在脊索下方中线平面发现一群在低氧期间持续激活的细胞，通过细胞类型特异性成像Tg(th:gal4; UAS:GCaMP6f)和WB-ExM-IF/FISH确认其为交感神经节，且其轴突沿肠系膜动脉分布，建立了功能性脑-肠系膜动脉通路。

四、讨论与结论

WHOLISTIC建立了一种弥合细胞生理学与机体生理学的系统生物学新范式。未来在自由活动动物中的实现将支持在自然情境下研究全身细胞控制系统，多模式虚拟现实环境将促进生理状态与行为策略之间相互作用的研究。钙传感器为细胞活动提供了有效代理，但细胞间信号还涉及电压、机械和多种分子通路，WHOLISTIC可扩展至共成像日益丰富的分子、电压和机械传感器。鉴于多细胞相互作用的规模和复杂性，揭示高阶相互作用需要结合图神经网络、大规模生物物理模型和经验动态建模等先进分析框架。平台自动化与人工智能闭环系统的结合将支持基础生物学发现和实时医疗干预的原型设计。本研究中所有发现——涉及不同细胞类型、身体不同部位、不同生理检测和筛选——均源于同一WHOLISTIC方法，凸显了其基础生物学和医学研究的广泛适用性。将全身细胞活动成像与全身扩张显微术相结合，提供了在规模上桥接功能与机制的途径，但需要开发能够将体内与离体扩张数据逐细胞匹配的全身配准方法。结合光遗传学扰动，WHOLISTIC能够因果解析应激等生理条件下细胞类型特异性的脑-体通路，为理解机体整体调控机制提供了前所未有的工具。