《FEBS Open Bio》：Exploring the influence of lactoferrin on wound healing and related signaling pathways: a systematic review
本系统评价评估了乳铁蛋白（Lf）在伤口愈合过程中的治疗效果和生物学机制。其目的是综合关于Lf在细胞再生、基因调控和抗菌保护中的多功能作用的证据。在初步筛选的1846条记录中，有11项体外研究（2001–2023年）符合纳入标准。综合数据表明，Lf显著加速人角质形成细胞和成纤维细胞的迁移与增殖。在分子水平上，Lf上调关键的再生基因，特别是HAS2（透明质酸合成）和COL1A1（I型胶原蛋白）。此外，Lf对生物膜形成和细菌生长表现出有效的抑制作用，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）具有高效活性。因此，Lf作为一种关键的生物活性因子，在伤口愈合的所有阶段中连接了再生刺激与抗菌防御。其调节细胞外基质和抑制病原体的能力提示其可作为先进伤口护理和再生治疗的候选分子。这些发现为向临床阶段的生物勘探转化奠定了坚实的生物学基础。
材料与方法
注册与方案
本系统评价按照系统评价和荟萃分析首选报告项目（PRISMA 2020）指南进行并报告。研究方案已在开放科学框架（OSF）中前瞻性注册（https://osf.io/tsrpc/）。该评价旨在基于PICO框架回答以下研究问题：（1）Lf给药是否在皮肤伤口愈合的体外模型中显著调节细胞活动（增殖、迁移和分化）？（2）Lf在组织修复的不同阶段发挥作用的特定分子机制是什么？
纳入标准
纳入标准仅限于探讨Lf对伤口愈合过程的细胞和分子机制影响的原始体外实验研究（例如，成纤维细胞和角质形成细胞活性、血管生成和炎症调节）。将范围限定于体外研究的决定旨在提供对Lf直接机制通路的高分辨率分析，最小化体内模型固有的系统性混杂因素。排除标准包括：（a）二次研究（综述、荟萃分析、社论或评论）；（b）Lf与其他活性药理化合物联合使用且无法确定Lf单独效应的研究；同时，若研究设计包含未功能化的对应物或基质对照（如裸纳米颗粒或分离的聚合物载体），则纳入含有Lf的功能化生物材料、纳米复合材料或分子结合物，以分离并确定Lf的特异性生物学贡献和治疗附加价值；（c）缺乏适当对照组的研究；（d）灰色文献，如会议摘要、专利和书籍章节。仅纳入以英文发表的研究，以确保技术科学数据提取的精确性。未设置日期限制。因谷歌学术（Google Scholar）对新兴主题的精确度较低而未纳入。
检索策略
在PubMed/MEDLINE、Scopus、Web of Science、Cochrane Library、Embase、ScienceDirect和LILACS中进行了全面检索。检索涵盖截至2026年1月的所有文献，无初始日期限制。检索策略使用了医学主题词表（MeSH）术语（表1）。
研究选择与数据提取
两名独立评审员（MLA和GPC）使用Zotero进行标题和摘要筛选，以去除重复文献并进行初步选择。依据纳入标准进行全文评估。三名评审员（MLA、KCH和MSF）使用标准化Excel表格独立进行数据提取。提取的数据包括：研究标识（作者、年份）、Lf来源/类型、所用细胞系、浓度、处理时间及主要结果（分子标志物和细胞行为）。分歧由第三名评审员（RGL）解决。
质量与偏倚风险评估
两名评审员（MLA和KCH）使用ToxRTool（毒理学数据可靠性评估工具）的体外模块独立评估所有符合条件的全文文章的信度和质量。该工具由Schneider及其同事开发，提供了详细的标准和指南来评估毒理学数据的内在质量，旨在使可靠性类别的分类更加一致和透明。每项研究根据18项预定义的二元标准进行评估，总评分用于基于类似Klimisch系统分配可靠性类别。在该框架中，类别1（“无限制可靠”）指根据有效和/或国际公认指南进行的研究，最好在良好实验室规范（GLP）下进行。类别2（“有限制可靠”）适用于可能不完全符合GLP标准但记录充分且科学可接受的研究。类别3（“不可靠”）保留给存在重大方法学局限和文件不充分的研究；尽管此类研究可能提供支持性信息，但其内部有效性受损。为评估评审员间信度，使用Cronbach's α量化两名评审员之间的一致性水平，该值根据每项研究的评分计算。发现的任何主要方法学缺陷均以自由文本形式定性记录，并在结果部分的汇总表中呈现。
数据综合
实施了定性综合，以整合关于Lf在伤口愈合各阶段疗效的发现。鉴于细胞系和Lf浓度预期存在异质性，未计划进行荟萃分析；然而，结果按生物学机制（如抗炎、促增殖或重塑）分组，以提供Lf治疗潜力的结构化概述。
结果与讨论
研究选择与纳入
初步检索从所选数据库获得1846条记录。去除重复项后，剩余1159条记录进行标题和摘要筛选。其中977篇文章被选作全文审查。全文评估后，955篇文章因不符合纳入标准被排除。在剩余的22篇文章中，另有11篇因未进行体外分析而被排除（图1）。最终，11项研究符合纳入标准并被纳入本评价。纳入研究发表于2001年至2023年间，多数来自日本、马来西亚和美国。这些结果也在下图中描述和展示（图2）。使用ToxRTool体外模块对11项纳入研究进行的可靠性评估显示，5篇文章被归类为类别1（“无限制可靠”），6篇被归类为类别2（“有限制可靠”）。没有研究获得类别3（“不可靠”）评级。研究中最一致的优点是实验方法的清晰描述、适当对照的使用以及检测的重复性。相反，主要缺点是缺乏随机化、未设盲以及生物学重复的报告有限。评审员间的一致性较高（Cronbach's α > 0.80），支持评分过程的稳健性。
研究目的与主要结果
本系统评价纳入的11项研究探讨了Lf在与伤口愈合相关的不同实验背景下的效应。大多数研究旨在评估Lf的抗菌特性及其促进组织修复关键细胞过程（如角质形成细胞和成纤维细胞增殖、血管生成和细胞外基质合成）的能力。其他研究侧重于开发基于Lf的生物材料，包括水凝胶和敷料，旨在结合抗菌和促再生活性。各研究的样本量不同，多数采用小规模体外检测（n=3至n=6）。关于Lf的来源，使用了牛乳铁蛋白（bLf）和人乳铁蛋白（hLf），其中bLf因其可及性和与hLf的结构相似性而最常使用。报告的主要结果包括增强细胞增殖和迁移、增加胶原蛋白和透明质酸的产生，以及对常见伤口感染病原体（如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）的有效抗菌活性。这些发现总结于表1。
尽管初步检索同时涉及体外和体内模型的研究，本评价仅聚焦于体外检测，以确保实验设计的一致性并便于分析Lf的细胞和分子效应。体内研究在动物物种、伤口诱导方法、Lf剂量和应用方案方面存在显著异质性，使直接比较具有挑战性。相比之下，体外模型提供了受控环境，能够详细研究基本过程，如角质形成细胞迁移、成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积和血管生成信号传导。然而，体外研究中选择细胞模型反映了实验可行性与生理相关性之间的关键平衡。永生化细胞系（如HaCaT角质形成细胞和L929成纤维细胞）具有实用性和可重复性，但可能表现出改变了的基因表达谱和相较于原代细胞降低的反应性。另一方面，原代角质形成细胞、人胚胎肾（HEK）细胞和人真皮成纤维细胞保留了天然特征并提供更生理相关的反应，尽管存在技术挑战和可重复性降低的问题。这种细胞模型的变异性强调了需要协调方案以提高研究间的可比性，并加强体外发现的转化潜力。
所用细胞模型
所有纳入研究均采用体外模型来探讨Lf对伤口愈合相关关键过程的影响。人角质形成细胞和成纤维细胞系是最常用的细胞，反映了它们在细胞外基质合成、再上皮化和整体伤口修复中的核心作用。有趣的是，两项研究使用了替代细胞类型：HEK细胞和L929小鼠成纤维细胞。虽然HaCaT细胞因其稳健性和易于培养而被广泛用作永生化角质形成细胞模型，但HEK细胞代表了一种完全不同的源自肾脏的人上皮细胞谱系。因此，对这些模型之间的明确功能对比需谨慎解读，因为HEK细胞保留了天然胚胎肾上皮行为而非表皮特征。HaCaT细胞往往对促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的反应性降低，可能低估伤口修复的炎症阶段。此外，其分化能力可能不同于原代角质形成细胞，尤其是在应激或响应生物活性分子时。
L929成纤维细胞（一种鼠成纤维细胞系）的使用可能与其在细胞毒性检测中的广泛应用和易于培养有关。然而，必须考虑信号通路和细胞外基质产生方面的物种特异性差异，因为这些细胞可能无法完全重现人真皮成纤维细胞的行为。此类种间变异性凸显了根据具体研究目标选择合适的细胞模型的重要性。
因此，HEK细胞的使用使得表皮反应评估更具生理相关性，而L929细胞因其在细胞毒性检测中的广泛使用和易于维持而被选用。细胞模型的这种变异性突显了生理相关性方面的潜在差异，并可能影响各研究结果的可比性。相比之下，HEK细胞保持了更贴近生理条件的基因表达谱。它们对角质形成细胞特异性标志物的调节更准确，并对炎症和氧化刺激具有自然反应性。这些特征使HEK细胞在旨在阐明密切模拟天然表皮的分子机制的研究中极具价值。然而，其有限的寿命和对培养条件的敏感性带来了技术挑战，并降低了各实验室间的可重复性。
大多数研究使用比色法评估细胞活力，特别是AlamarBlue?和MTT法，反映了它们在体外模型中测量细胞代谢活性的广泛应用。这些检测因其灵敏性和适合检测细微细胞毒性效应而受到认可，使其成为筛选潜在伤口愈合剂的首选。不同研究的暴露时间和Lf浓度各异，但大多数在测试范围内未报告细胞毒性效应。然而，这些方法学差异导致了结果的可变性，并强调未来研究中标准化方案的必要性。表2总结了纳入研究的实验组、用于评估细胞毒性的检测方法、所用细胞模型以及关于细胞活力的关键发现。
细胞迁移与增殖
纳入研究使用多种检测方法探讨了Lf对细胞迁移和增殖的影响，主要是划痕伤口愈合检测、荧光显微镜和比色测量（表S1）。这些方法能够评估伤口修复中的两个基本过程：驱动再上皮化的角质形成细胞迁移，以及对肉芽组织形成和细胞外基质重塑至关重要的成纤维细胞增殖。HaCaT角质形成细胞和人真皮成纤维细胞（NHDFs）是最常用的细胞系，因为它们在这些生物过程中的相关性。此外，两项研究使用了替代模型，如HEK细胞和L929鼠成纤维细胞，以深入了解细胞行为的更具体方面。
Lf的促愈合作用
在各研究中，Lf一致地表现出增强角质形成细胞迁移和成纤维细胞增殖的能力。Tang等人表明重组人乳铁蛋白（rhLf）增加HaCaT迁移和增殖速率，这与体外伤口闭合加速相关。类似地，Saito等人报道bLf通过刺激透明质酸和胶原蛋白产生来促进成纤维细胞运动性和细胞外基质合成。在另一项研究中，Abdalla等人（2021）证明葡甘露聚糖-Lf复合物对角质形成细胞迁移具有协同效应，表明此类组合可能提供增强的治疗益处。多项研究强调了这些效应的剂量和时间依赖性，较高浓度的Lf通常产生更强的促迁移和促增殖反应而不诱导细胞毒性。
在分子水平上，Lf的促愈合作用通过调节关键信号通路和调控参与组织再生的基因来介导。多项研究突出显示了PI3K/Akt通路的激活，该通路通过增强细胞骨架动态和能量代谢促进细胞存活、增殖和迁移。例如，Ryu等人证明bLf与成纤维细胞上的低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）相互作用，激活PI3K/Akt信号并上调弹性蛋白（tropoelastin，TE）表达。TE是一种关键的细胞外基质蛋白，有助于皮肤弹性和结构完整性。
类似地，Tang等人（2010）报道重组hLf通过MAPK和Rho/ROCK通路调节角质形成细胞迁移和增殖。这些通路协调细胞骨架重塑、黏着斑周转和细胞运动性——这些是有效再上皮化所必需的过程。此外，Takayama等人（2001）鉴定了由Rho/ROCK和MLCK依赖性通路介导的肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化增加，进一步支持Lf在增强成纤维细胞收缩性和伤口闭合中的作用。
在细胞外基质水平上，Saito等人（2010）证明bLf处理显著上调NHDFs中的透明质酸合酶2（HAS2）和I型胶原蛋白（COL1A1），导致细胞外基质合成和成纤维细胞迁移增强。这些发现与Abdalla等人（2021）一致，他们观察到Lf与葡甘露聚糖联合使用时对迁移和细胞外基质重塑的协同效应。此外，在一些模型中报道了血管内皮生长因子（VEGF）表达增加，提示其对伤口愈合中血管生成的贡献。
总体而言，这些研究突显了Lf的多方面分子作用，包括基因表达调控、细胞外基质产生调节以及协调细胞增殖、迁移和血管生成的信号通路激活。将这些机制见解整合到图形模型中可能有助于说明Lf在伤口愈合不同阶段的作用，从炎症到组织重塑，并为其在再生医学中的治疗潜力提供概念框架。
Lf作为中心分子调节参与伤口修复的多种细胞内信号通路。PI3K/Akt通路的激活促进细胞存活、增殖和迁移。由Rho/ROCK/MLCK通路介导的TE上调和MLC磷酸化增强成纤维细胞收缩性和伤口闭合。MAPK/Rho-ROCK轴调节细胞骨架重塑，而COL1A1和HAS2的诱导支持细胞外基质合成和再上皮化。这些机制共同促进伤口愈合的炎症、增殖和重塑阶段。
抗菌活性
除细胞内信号传导效应外，Lf还通过调节伤口微环境中关键生长因子的表达发挥旁分泌作用。Belvedere等人（2021）证明Lf上调VEGF，促进血管生成，这对向再生组织供应营养和氧气至关重要。Ryu等人报道转化生长因子-β（TGF-β）有助于成纤维细胞募集和细胞外基质沉积，支持肉芽组织形成。此外，Abdalla等人和Jiang等人表明Lf增强表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的表达，这些因子刺激角质形成细胞增殖、成纤维细胞迁移和组织重塑。这些协调效应说明了Lf在协调细胞反应和促进有效伤口愈合中的多方面作用（图3）。
VEGF刺激血管生成，TGF-β支持成纤维细胞募集和细胞外基质沉积，EGF促进角质形成细胞增殖和再上皮化，FGF有助于成纤维细胞迁移和组织再生。总之，这些旁分泌效应突显了Lf在协调细胞反应和增强组织修复中的作用。
除细胞模型外，大多数研究评估了Lf对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性（表3）。优先选择这两种物种是因为金黄色葡萄球菌是伤口感染中常见的优势革兰氏阳性病原体，而大肠杆菌是常与污染和伤口愈合延迟相关的革兰氏阴性模式生物。它们在慢性和急性伤口环境中的临床相关性强调了测试Lf对这些细菌功效的重要性。
关于抗菌检测，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是最常评估的病原体。这一选择与它们的临床相关性一致，因为金黄色葡萄球菌是伤口感染中的主要革兰氏阳性菌，而大肠杆菌是常与污染和伤口愈合延迟相关的代表性革兰氏阴性菌。Lf表现出多方面的抗菌机制，有助于其对上述病原体的有效性。其铁结合能力剥夺了细菌这种必需微量元素，通过限制微环境中的铁可用性发挥抑菌作用。此外，Lf直接与细菌细胞膜相互作用：在革兰氏阴性菌如大肠杆菌中，它与脂多糖（LPS）结合， destabilizing 外膜并增加通透性，最终可能导致细胞裂解。对于革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌，Lf通过结合磷壁酸并扰动膜完整性来破坏细胞壁。这些相互作用不仅抑制细菌生长，还使病原体对其他抗菌剂敏感。
Lf的另一个关键特性是其抑制生物膜形成的能力，这是伤口病原体逃避宿主防御和抗菌治疗的常用策略。Lf干扰细菌黏附和群体感应通路，减少伤口表面生物膜的形成和成熟。除直接抗菌作用外，Lf还以支持伤口愈合的方式调节宿主免疫反应。已有报道称其增强中性粒细胞和巨噬细胞的募集和激活，促进防御素等抗菌肽的产生，并调节促炎和抗炎细胞因子的释放。Fathil等人（2023）强调，将Lf掺入先进生物材料中可显著减少金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等病原体的生物膜形成，同时支持利于细胞迁移和平衡炎症的微环境。生物膜形成抑制分析的结果见表S2。
在伤口愈合中的多方面作用
尽管各研究之间存在方法学差异，如Lf剂量和治疗方案的不同，但大多数研究报告了Lf对伤口愈合结果的一致有益效应。这些综合特性表明Lf在多个层面发挥作用，以减少微生物负荷、调节炎症并预防感染相关并发症，使其成为管理感染伤口和防止慢性化策略中的有前途的辅助手段。
在修复早期，Lf强大的抗菌和抗炎活性通过减少细菌定植和调节过度炎症反应间接支持愈合。这些效应在选用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为感染模型的研究中尤为明显，其中Lf显著减少生物膜形成并增强抗菌肽表达。此外，如Fathil等人所示，Lf的免疫调节活性有助于更平衡的炎症反应，调节促炎和抗炎细胞因子的释放，以防止过度组织损伤同时保持有效的微生物清除。
在增殖期，Lf直接作用于组织再生。在核心研究中，Lf一致地增强角质形成细胞和成纤维细胞增殖，这些过程对再上皮化和细胞外基质重塑至关重要。具体而言，Abdalla等人（2020）和Jiang等人（2017）表明Lf增强表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的表达，这些因子刺激角质形成细胞增殖、成纤维细胞迁移和组织重塑。同时，Yuan等人和Fathil等人提供的证据表明，Lf无论是缀合还是未缀合形式，均通过加速伤口收缩和促进血管生成来促进伤口修复，从而改善伤口微环境中的血管化和营养供应。
在重塑的最后阶段，Lf支持组织结构的恢复。Ryu等人观察到胶原蛋白和透明质酸合成增加，这对于恢复拉伸强度至关重要。此外，他们报道转化生长因子-β（TGF-β）有助于成纤维细胞募集和细胞外基质沉积，支持肉芽组织形成。除这些再生特性外，该化合物还表现出有效的抗氧化活性，这对于防止可能损害伤口闭合的长期氧化应激至关重要。
尽管有这些有前景的发现，但11篇纳入论文中完全使用体外模型限制了对复杂体内系统结果的直接外推。此外，方法学异质性和缺乏标准化剂量方案使文献间的直接比较变得复杂。未来研究应在动物模型和临床试验中验证这些发现，并探索将Lf掺入先进伤口敷料和生物材料中以最大化其治疗效益。
结论
本系统评价突显了Lf在伤口愈合中的多功能作用，强调其在调节细胞过程、调控信号通路以及整合再生、免疫调节和抗菌特性方面的重要性。通过汇编多样化的体外模型和方法，该研究提供了Lf潜在应用的广泛概述，同时指出了未来研究中应解决的异质性。在此背景下，Lf作为再生医学和组织工程中创新疗法开发的有前途的候选分子，加强了其在新型伤口护理策略生物勘探中的重要性。然而，该领域的进展依赖于转化进展以及设计良好的临床前和临床研究，以验证和优化其治疗应用。
