《The Journal of Pathology》：Network based approach identifies miR-145-3p as a central regulatory hub associated to the progression from localized to metastatic medullary thyroid carcinoma
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甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是一种起源于产生降钙素的C细胞的神经内分泌肿瘤，占甲状腺癌的1%–5%。全甲状腺切除术可治愈局限性疾病（N0），而淋巴结转移（N1）与较差的预后相关。然而，驱动转移转变的分子机制仍知
甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是一种起源于产生降钙素的C细胞的神经内分泌肿瘤，占甲状腺癌的1%–5%。全甲状腺切除术可治愈局限性疾病（N0），而淋巴结转移（N1）与较差的预后相关。然而，驱动转移转变的分子机制仍知之甚少。本研究旨在识别与MTC转移扩散相关的miRNA特征，重点关注从N0向N1的转变。研究人员构建了N0和N1肿瘤的共表达网络，并利用差异连接性分析识别作为调控枢纽的关键miRNA。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体论（Gene Ontology，GO）和Reactome通路分析对其靶基因进行功能注释。在MTC细胞中开展验证实验，以评估所选miRNA对细胞增殖、存活和MAPK通路激活的影响。网络分析揭示了N0和N1肿瘤之间不同的miRNA共表达模式。差异网络分析突出显示miR-145-3p是一个核心调控枢纽，在N1中表现出29个改变的共表达变化和显著的连接性丧失。靶点富集分析鉴定出59个已验证基因，包括关键致癌驱动因子MYC、PTEN、BCL2、PIK3CA、AKT1和MAPK7。在MTC细胞中，同时抑制miR-145-3p及其排名靠前的共表达miRNA可增加增殖和存活，并增强ERK磷酸化，表明MAPK通路激活以及向更具侵袭性表型的转变。总之，本研究鉴定了一个以miR-145-3p为中心的miRNA调控枢纽，该枢纽与转移进展相关，并强调了基于网络的方法在揭示癌症播散机制中的价值。
### 论文解读：基于网络分析揭示miR-145-3p在甲状腺髓样癌从局限期向转移期进展中的核心调控作用
**一、研究背景与问题**
甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是一种罕见的神经内分泌肿瘤，起源于甲状腺滤泡旁降钙素产生细胞，约占所有甲状腺恶性肿瘤的1%–5%。MTC的发生既可为散发性（约占75%–80%），也可作为遗传性综合征的一部分。RET原癌基因和RAS基因家族突变是MTC最常见的驱动突变。目前，手术是MTC的主要治疗手段，全甲状腺切除术常被推荐用于多灶性肿瘤。对于局限期（N0）患者，手术通常可治愈，10年生存率高达95.6%；而出现淋巴结转移（N1）的患者预后居中，10年生存率约为70%；远处转移者预后更差，10年生存率仅约40%。淋巴结转移是肿瘤播散的首个关键步骤，且可能发生在疾病早期。尽管对MTC生物学已有一定认识，但驱动早期播散的分子机制仍不清楚。microRNA（miRNA）作为转录后水平调控基因表达的小非编码RNA，在肿瘤发生发展中发挥重要作用，已被证实参与MTC进展并可作为诊断和预后生物标志物。然而，既往研究多聚焦于单个miRNA，缺乏系统层面的网络视角。为此，需要采用能够刻画复杂分子调控关系的网络分析方法，比较局限期（N0）与淋巴结转移期（N1）MTC组织中的miRNA共表达模式，从而识别与早期转移相关的核心调控因子及信号通路。
**二、研究设计与方法概述**
该研究收集了来自意大利多个临床中心（包括罗马萨皮恩扎大学、锡耶纳大学、比萨大学医院及那不勒斯G. Pascale国家肿瘤研究所）的28例散发性MTC患者肿瘤样本，其中13例为局限期（N0M0），15例为淋巴结转移期（N1M0）。研究人员对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻（FF）样本提取RNA，利用TaqMan低密度阵列（TLDA）获得miRNA表达谱，最终纳入433个miRNA进行分析。在方法层面，研究构建了N0与N1两个分组的miRNA共表达网络（基于Spearman相关系数），采用Louvain方法分析网络社群结构；运用Fisher z检验建立差异共表达网络，识别两组间共表达关系发生显著改变的miRNA对；通过度中心性指标筛选网络枢纽节点。随后，利用STRING数据库对miR-145-3p及其N0共表达邻居（N0CN）的59个已验证靶基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析及KEGG、基因本体论（GO）和Reactome通路富集分析。在功能验证中，研究人员使用MTC来源的TT细胞系（携带C634W RET突变），通过转染miRCURY LNA miRNA抑制剂池（包括miR-145-3p、miR-126-3p、miR-24-3p、miR-592）进行联合抑制实验，采用MTS法检测细胞增殖、台盼蓝排斥法检测细胞死亡、划痕愈合实验评估迁移能力，并通过western blot检测ERK磷酸化水平，实时定量PCR检测MYCN、CCND1、NF-κB等基因表达。临床关联分析采用逻辑回归、Spearman秩相关、Kaplan–Meier生存曲线及log-rank检验。
**三、主要研究结果**
**1. N0与N1的miRNA共表达网络呈现显著重组**
通过对28例MTC患者miRNA表达谱进行共表达网络分析，研究人员发现N0组的网络呈现两大主要社群（分别含217和210个miRNA），两社群内部高度正相关，而彼此间强烈负相关；N1组则重新组织为三个新社群（蓝色、橙色和黄色）。桑基图显示，N0中fuchsia和turquoise社群中的部分miRNA在N1中汇入新的黄色社群。该结果表明，从N0向N1进展过程中，miRNA共表达网络发生了深刻的结构重组。
**2. miR-145-3p被鉴定为差异网络的中心枢纽**
差异共表达分析显示，433个miRNA中244个参与最大的差异网络连通分量，其中大多数miRNA的边数较少，且从N0到N1失去的连接多于新获得的连接。miR-145-3p参与了29个显著的共表达变化（19个为N0中更强，10个为N1中更强），成为度中心性最高的节点，被确定为区分N0与N1状态的核心枢纽。在N0中miR-145-3p及其16个直接共表达邻居（N0CN）整体表达较高，而这一网络在N1中明显减弱或沉默，提示其调控机制可能在肿瘤进展中丢失。
**3. 靶基因富集揭示与MTC相关的致癌通路**
对miR-145-3p及N0CN的59个已验证靶基因进行PPI分析，发现其相互作用网络包含MYC、PTEN、BCL2、PIK3CA、AKT1、MAPK7等与肿瘤发生发展相关的高连通性致癌枢纽。KEGG富集分析显示，排名前三的通路为“microRNAs in cancer”、“endocrine resistance”和“EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance”。GO生物过程富集显示靶基因参与凋亡过程的负调控、细胞死亡和分化；分子功能富集显示涉及蛋白质结合和DNA结合活性。Reactome数据库分析则突出显示了受体酪氨酸激酶（RTK）、免疫系统、细胞因子和雌激素相关信号通路的富集。这些结果共同指向RTK/RAS/RAF/MEK/ERK轴在MTC中的核心地位。
**4. 四-miRNA网络的临床相关性与功能验证**
研究人员从N0相关网络中选出四个miRNA（miR-145-3p、miR-126-3p、miR-24-3p、miR-592），基于其在N0样本中高表达、与miR-145-3p强正相关且N0与N1间差异显著。临床分析显示，多变量逻辑回归中年龄、T分期和RET M918T突变状态与N1状态显著相关，但将miR-145-3p加入模型后并未显示独立相关（校正OR 1.29，95% CI 0.96–1.95，p=0.14）。N1组PFS显著差于N0组（p=0.042），但miR-145-3p单指标或四-miRNA联合评分均未显著分层临床结局；miRNA与淋巴结状态或术前降钙素水平亦无显著关联。不过，由于样本量小、事件数少，统计功效受限。功能实验中，在TT细胞中联合抑制四个miRNA后，细胞增殖显著增加，细胞死亡呈现减少趋势；划痕愈合虽加快但未达统计学显著。Western blot显示ERK磷酸化（pERK/ERK）水平显著升高，而pAKT无变化。qPCR结果显示MYCN、CCND1和NF-κB mRNA水平显著上升，TWIST1、TWIST2、HES1、HES5呈上升趋势但不显著。这些结果表明，破坏N0 MTC特征性的miRNA网络促进了更具侵袭性的细胞表型，支持该网络在限制肿瘤进展中的功能作用。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，miR-145-3p在多种肿瘤中被认为是肿瘤抑制因子，例如在肺腺癌和头颈部鳞状细胞癌中靶向致癌驱动基因MYO1B；在甲状腺乳头状癌中，miR-145过表达可通过靶向PI3K/AKT和N-cadherin通路抑制增殖、侵袭和上皮间质转化（EMT）。尽管关于miR-145-3p在MTC中的直接数据有限，但本研究的富集分析显示其靶基因显著富集于MTC相关通路，包括RTK和免疫系统信号。PIK3CA、AKT1和MAPK7作为miR-145-3p潜在靶点，提示其下调可能导致MTC中MAPK和PI3K/AKT通路的失控。功能验证进一步表明，miR-145-3p及其N0CN的联合抑制激活MAPK信号通路、上调MYCN、CCND1和NF-κB等MTC进展标志物。
研究结论可概括为：本研究通过网络分析方法，揭示了MTC从N0向N1转变过程中miRNA共表达网络的显著重组，并鉴定出以miR-145-3p为中心的调控枢纽。该枢纽在局限期肿瘤中维持一个抑制性网络，其失活可促进RTK/MAPK/PI3K信号通路的激活，进而驱动肿瘤进展。该研究超越了单miRNA研究模式，提供了系统层面的调控回路视角，可能为MTC的联合治疗靶点或预后特征提供新思路。同时，研究承认样本量较小且仅使用一种MTC细胞系，结论外推需谨慎；但网络分析在罕见肿瘤研究中具有独特价值，能够在有限样本中揭示多分子协同作用。总体而言，该研究发表在《The Journal of Pathology》，强调了基于网络的方法在阐明癌症播散机制中的重要性。
