反相手性液相色谱法对药物制剂中乌帕替尼的对映体选择性测定

《Journal of Separation Science》：Enantioselective Determination of Upadacitinib in Pharmaceutical Formulations Using Reversed-Phase Chiral Liquid Chromatography

　　

立体化学杂质即使在微量水平也可能显著改变药物的药理特性并危及患者安全。因此，开发选择性手性分析方法对于质量控制保障至关重要。本研究开发了一种新型手性高效液相色谱（HPLC）方法，用于乌帕替尼（UPA）的对映体分离与定量分析。乌帕替尼是一种选择性JAK-1抑制剂，用于治疗类风湿关节炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病。采用实验设计方法中的Box-Behnken设计（BBD）评估流动相pH值、乙腈含量和柱温对分离度（resolution）和峰宽响应的影响。基于实验结果，优化色谱条件以实现最佳分离性能。在反相条件下，使用Chiralcel OJ–RH色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm）于40°C实现手性分离。流动相由20 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）与乙腈（84:16，v/v）组成，等度洗脱流速为0.7 mL/min，检测波长为340 nm。基线对映体分离的分离度值为2.51。依据ICH Q2(R2)指南，从专属性、线性、准确度、精密度和耐用性方面对该方法进行了验证。乌帕替尼及其3R,4S对映体在0.1–12.8 μg/mL浓度范围内获得良好线性。经验证的方法成功应用于市售片剂中乌帕替尼的定量分析，并通过多种工具对其环境影响和实用性进行了评估。本研究首次报道了经充分验证的反相手性HPLC方法用于乌帕替尼的对映体分析。

论文解读：反相手性液相色谱法用于乌帕替尼对映体选择性测定的研究

一、研究背景与意义

Janus激酶（JAK）抑制剂广泛用于免疫功能障碍疾病如类风湿关节炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病的治疗。其中，乌帕替尼（UPA）是一种选择性JAK-1抑制剂，在细胞试验中对JAK-2的选择性超过60倍，对JAK-3超过100倍，这种高选择性减少了抑制JAK-2和JAK-3所带来的副作用。2019年美国食品药品监督管理局（FDA）批准UPA用于治疗类风湿关节炎，随后陆续获批其他适应症。

然而，关于UPA立体异构体对JAK1或其他亚型影响的研究尚未见报道。虽然原始合成专利中未包含UPA或其镜像体的具体数据，但对一种UPA类似物（AA.1.77）及其对映体（AA.1.76）的研究表明，前者IC₅₀值小于0.1 μm，而对映体无活性（IC₅₀大于1 μm），这揭示了该类化合物立体化学的关键作用。现有文献中UPA定量分析方法较少，包括非手性的HPLC、LC–MS/MS、电化学技术等方法，而唯一报道的手性方法是基于正相（NP）条件使用ChiralPak IG色谱柱实现的。正相方法通常需要使用大量有毒有机溶剂，且与质谱联用兼容性较差。

鉴于立体化学杂质即使在痕量水平也可能显著改变药物药理学特性并危及患者安全，开发选择性手性分析方法对于严格的质量控制至关重要。本研究旨在建立并验证一种更环保、适用性更广的反相（RP）手性HPLC方法，用于UPA及其对映体的分离与定量，以满足日常质量控制需求。该论文发表于《Journal of Separation Science》。

二、关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术手段：首先，利用Box-Behnken设计（BBD）这一实验设计（DoE）方法来系统优化影响手性分离的关键参数；其次，应用反相手性液相色谱技术，选用纤维素基手性固定相Chiralcel OJ-RH色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm）进行分离；第三，采用响应面法（RSM）评估变量间的交互效应并确定最优条件；最后，运用绿色分析化学（GAC）评价工具，包括AGREE、改进的绿色分析程序指数（MoGAPI）和蓝色适用性等级指数（BAGI），对方法的环保性和实用性进行综合评估。

三、研究结果

3.1 初步筛选与参数选择

通过单因素逐一研究方法筛选最影响UPA对映体分离的因素。首先比较两种多糖基色谱柱——ChiralPak IC（含纤维素三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)）和ChiralCel OJ-RH（含纤维素三(4-甲基苯甲酸酯)），发现后者提供更好的对映体分离效果。有趣的是，在先前对talazoparib的研究中，相同两根色谱柱表现出相反的分离偏好，凸显了手性识别的分析物依赖性特征。有机改性剂对比显示，乙腈比甲醇提供显著更好的分离度。缓冲液pH考察发现，近中性条件（pH 6.0）下分离度明显改善。考虑到色谱柱制造商建议在pH高于7时操作温度不应超过25°C的限制，后续实验在受限pH范围和受控温度条件下进行。检测波长设为340 nm，提供了足够的灵敏度和信噪比。

3.2 基于实验设计的优化

采用BBD优化分离条件，将乙腈百分比、缓冲液pH和柱温选为自变量，峰宽和分离度为响应变量。基于15次随机顺序实验的数据，建立了二次响应面模型，所有模型均具有统计学显著性（p < 0.05）。高决定系数（R²）表明模型具有良好的预测可靠性。方差分析结果显示，乙腈含量对峰宽和分离度影响最大——较高乙腈比例缩短峰宽但降低对映体分离度；缓冲液pH主要影响分离度；升高柱温通常改善分离行为。部分交互项和二次项也显著，表明响应受到组合和非线性效应影响。最终优化条件确定为：16%乙腈、20 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）、柱温40°C、流速0.7 mL/min、进样量10 μL、检测波长340 nm，实验值与模型预测偏差约5%。

3.3 方法验证

按照ICH Q2(R2)指南进行方法验证。系统适用性测试中，UPA保留时间21.05分钟，3R,4S对映体24.51分钟，分离度达2.51，拖尾因子分别为1.10和1.09，保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）均为0.62%和0.64%，均在可接受标准内。专属性通过空白色谱图中无干扰峰及峰纯度分析确认。在0.1–12.8 μg/mL浓度范围内，UPA和对映体的校准曲线相关系数（R²）均大于0.999，定量限（QL）为0.1 μg/mL，回收率分别为102.31%和100.54%，RSD分别为1.24%和1.76%。三个质控水平的准确度（回收率97%–105%）和精密度（RSD低于5%）均符合要求。在100 μg/mL UPA存在下定量0.1 μg/mL对映体杂质时，标准溶液和片剂溶液的回收率分别为98.78%和98.07%，RSD分别为1.20%和1.45%，证明该方法能在0.1%水平准确精密地定量对映体杂质。耐用性评估显示，微小参数变化下回收率保持在95.03%–105.3%。稳定性研究表明UPA溶液在不同储存条件下回收率变异低于6%。

3.4 强制降解研究

标准UPA溶液在酸性水解（0.1 M HCl）和氧化条件（1% H₂O₂）下24小时后表现相对稳定，回收率分别为101.03%和99.03%。而在碱性水解（0.1 M NaOH）条件下发生显著降解，室温下24小时回收率降至88.01%，70°C下进一步降至86.66%。尽管出现降解，但未在检测限内观察到归属于降解产物的额外色谱峰。峰纯度分析证实UPA峰的纯度值始终高于阈值，表明该方法能有效将UPA与其降解产物分离，适用于稳定性指示分析。

3.5 片剂分析

将所开发方法应用于Rinvoq片剂（标示量15 mg/片）中UPA的分析，在中等浓度（2.5 μg/mL）下测得回收率为96.76%，RSD为0.027%。

3.6 方法绿色性与实用性评估

AGREE评分为0.55（满分1分），反映中等绿色分析性能，主要扣分因素为乙腈的使用和离线操作模式。MoGAPI评估得分为70分（满分100分），在样品制备简便、试剂消耗有限和废物处理等方面表现积极。BAGI得分为77.5分（满分100分），表明该方法在日常使用中具有实际可行性。综合考虑手性色谱分离的内在限制，该方法在分析性能和环境影响之间取得了平衡。

四、结论讨论与翻译

本研究中开发并验证了一种用于UPA及其对映体手性分离的RP-HPLC方法。与先前报道的正相手性HPLC方法相比，反相方法在溶剂兼容性、简化样品制备和更广泛的适用性（包括与LC–MS系统的潜在联用）方面具有实际优势。尽管正相方法分析时间更短，但其流动相中的正己烷带来环境和安全隐患，这也反映在其较低的AGREE评分上。相比之下，本研究的反相方法通过降低流速和简化样品制备，减少了对有害溶剂的使用和总体溶剂消耗。

据研究人员所知，本研究首次报道了经充分验证的反相手性HPLC方法用于药物制剂中UPA的对映体选择性测定。该方法在选择性、线性、准确度、精密度和耐用性方面均成功验证，灵敏度高，对UPA及其对映体的定量限均达到0.1 μg/mL，低于正相方法报告的0.34 μg/mL。此外，该方法能够在活性成分100%水平下准确精密地定量0.1%水平的对映体杂质，使其适用于日常质量控制应用。

总体而言，所提出的RP-HPLC方法为UPA的常规质量控制和光学纯度评估提供了一种可靠且灵敏的手段，与传统方法相比具有更优的环境表现。