利用细胞外rRNA定量微藻中的病毒裂解

《MicrobiologyOpen》：Quantifying Viral Lysis in Microalgae Using Cell-Free rRNA

　　

病毒裂解是浮游植物死亡的主要驱动因素，也是海洋中溶解有机物的重要来源，然而对于真核浮游生物而言，该过程的定量和类群分辨测量仍然有限。在此，研究人员结合实验室感染实验与基于速率的建模框架，证明了溶解在细胞外培养基中的细胞外核糖体RNA(rRNA)可作为微真核生物病毒裂解的定量代理。研究人员研究了两个宿主-病毒系统：硅藻Chaetoceros tenuissimus感染单链RNA病毒(CtenRNAV)以及针胞藻Heterosigma akashiwo感染大双链DNA病毒(HaV)。通过明确考虑细胞外rRNA降解，研究人员根据细胞外18S rRNA动态量化了细胞裂解速率的代理指标，并观察到在病毒感染下，细胞归一化裂解速率增加高达46倍和302倍。在C. tenuissimus中，裂解峰值先于细胞丰度下降，表明在种群仍在增殖时已发生大量病毒裂解。相比之下，H. akashiwo在感染早期和晚期均表现出升高的裂解速率，这意味着部分宿主细胞在病毒复制之前经历快速、非生产性死亡，此外还有典型的裂解事件。该研究首次实验验证了细胞外rRNA作为微真核生物裂解死亡定量标记物的可行性，为估算自然浮游生物群落中特定类群的死亡率提供了一种可扩展的方法。

**研究背景与问题**

海洋原生生物贡献了约30%的海洋碳生物量，其中浮游植物作为初级生产者，在全球碳循环和海洋食物网中具有核心作用。细胞裂解是浮游植物死亡的重要途径，可释放胞内物质为溶解有机物(dissolved organic matter, DOM)，而病毒裂解(viral lysis)估计每天导致10%–40%的海洋微生物死亡。然而，由于缺乏指示细胞裂解的分子标记，定量病毒裂解对浮游植物死亡的贡献一直十分困难。此前研究在原核生物中证明，病毒裂解释放的核糖体RNA(rRNA)可作为裂解标记，并据此提出了基于核糖体测序的死亡率评估方法(Mortality by Ribosomal Sequencing, MoRS)，但该方法尚未在单细胞真核生物中验证。由于真核细胞具有复杂的胞内结构（如细胞核和细胞器）且病毒生活策略多样，MoRS不能简单外推至微真核生物。因此，研究人员选取两种代表性宿主-病毒系统，验证细胞外rRNA(cell-free rRNA)作为微真核浮游植物病毒裂解定量指标的可行性。

**研究内容与意义**

研究人员采用硅藻(diatom)Chaetoceros tenuissimus（株系NIES-3715）感染单链RNA病毒(single-stranded RNA virus, ssRNA病毒)CtenRNAV-II，以及针胞藻(raphidophyte)Heterosigma akashiwo（株系U13262）感染大双链DNA病毒(large double-stranded DNA virus, dsDNA病毒)HaV120，开展6天实验室感染实验，结合速率模型量化细胞外rRNA的产生动态。结果表明，病毒感染显著提高了细胞归一化的rRNA释放速率，最高达对照的46倍和302倍。该研究首次实验验证了细胞外rRNA可作为微真核生物裂解死亡的定量指标，提供了可扩展、类群分辨的浮游植物死亡率估算方法。论文发表在《MicrobiologyOpen》。

**关键方法**

研究人员使用两种宿主-病毒系统进行实验室感染实验，均以多重感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10起始，每日采样。通过0.22 μm过滤分离细胞与细胞外部分，提取RNA并逆转录为cDNA，用数字PCR(digital PCR, dPCR)定量18S rRNA和病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因。添加大肠杆菌(Escherichia coli)16S rRNA作为spike-in，测定细胞外rRNA的一级降解速率常数。建立基于速率的离散时间质量平衡模型，计算细胞外rRNA产生速率，并归一化为每个细胞的产生速率(cf-rRNA-PPC)。所有培养基于22°C、12小时光暗循环条件下进行。

**研究结果**

*3.1 宿主生长动态（有/无病毒）*

在C. tenuissimus中，未感染对照组细胞密度持续增长至第4天；病毒感染组在前期（前3天）生长与对照相当，后期（第3天后）生长率显著降低。在H. akashiwo中，病毒感染后细胞密度立即下降，且病毒处理组中异养细菌丰度显著升高（尽管添加了抗生素），表明病毒裂解液的细菌输入可能影响系统。

*3.2 rRNA在颗粒态和溶解态之间的重新分配*

C. tenuissimus病毒感染后，细胞外18S rRNA浓度在第4天达到峰值，显著高于对照组；而H. akashiwo病毒处理组细胞外rRNA浓度反而低于对照组，原因是降解加快。两种物种的细胞rRNA浓度与细胞密度均呈显著正相关（C. tenuissimus r=0.72；H. akashiwo r=0.94）。H. akashiwo病毒处理组的每细胞rRNA含量在后期（第4天后）显著升高，可能反映细胞生理状态变化。

*3.3 病毒增殖和病毒标记基因的时序变化*

两种系统中，感染性病毒颗粒数从第0天到第5天均显著增加（CtenRNAV-II从5.8×10⁵增至1.9×10⁸ MPN mL^?1；HaV120从7.6×10⁵增至1.4×10⁷ MPN mL^?1）。CtenRNAV-II的MCP cDNA在细胞部分于第4天达峰，细胞外部分于第5天达峰；HaV120的MCP cDNA在细胞部分于第2天达峰，细胞外部分于第4天达峰，表明病毒复制后释放到细胞外。

*3.4 细胞外rRNA降解*

Spike-in 16S rRNA呈指数衰减，符合一级动力学。C. tenuissimus实验的降解常数约为0.83–2.16 day^?1（半衰期7.7–20.0 h）；H. akashiwo对照组类似，但病毒处理组因引入细菌导致降解常数极高（8.43 day^?1，半衰期约2.0 h），该值基于前24小时估算并用于整个期间。

*3.5 细胞外rRNA产生*

C. tenuissimus病毒处理组的细胞外rRNA产生速率在第2–3天达到峰值，cf-rRNA-P