肺泡上皮βPAK相互作用交换因子（βPIX）缺失通过损害干细胞特性驱动自发性肺纤维化

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Alveolar epithelial depletion of βPAK-interacting exchange factor drives spontaneous pulmonary fibrosis by impairing stemness

　　

摘要
肺泡上皮干细胞的异常修复/再生是肺纤维化（PF）的关键驱动因素。尽管βPAK相互作用交换因子（βPIX）与干细胞信号传导相关，但其在肺纤维化（PF）中的作用尚不清楚。在此，研究人员生成了条件性βPIX基因敲除小鼠，以探究其在PF发病机制中的贡献。选择性耗竭肺泡2型（AT2）细胞中的βPIX导致小鼠出现进行性PF，再现了人类特发性肺纤维化（IPF）中观察到的关键特征，其中AT2细胞表现出显著降低的βPIX水平。对βPIX缺陷小鼠肺组织的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）揭示了具有衰老特征、处于过渡性干细胞状态的前体细胞的出现，以及活跃的、产生胶原蛋白的肌成纤维细胞。在机制上，βPIX的缺失通过下调Wnt/β-catenin信号通路损害了AT2细胞的干细胞特性。来自IPF患者的AT2细胞也呈现出β-catenin和Axin2水平降低，证实了Wnt/β-catenin信号通路的下调。使用糖原合酶激酶-3β抑制剂治疗可重新激活Wnt/β-catenin信号通路，并减轻βPIX缺陷小鼠的纤维化。研究结果确立了βPIX缺乏与PF之间的直接因果关系，突出了βPIX及其下游通路作为这一毁灭性疾病有前景的治疗靶点。

**论文解读：βPIX缺失驱动自发性肺纤维化的机制研究**

**一、研究背景与问题提出**

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性且最终致命的间质性肺疾病，其特征是肺泡结构不可逆破坏和肺实质内细胞外基质过度沉积。尽管IPF的确切病因尚未完全阐明，但该疾病主要影响老年个体，并与衰老相关的病理过程密切相关，包括细胞衰老、组织再生能力受损和慢性上皮功能障碍。IPF的临床预后仍然较差，诊断后中位生存期约为3至5年，与许多恶性肿瘤相当或更差。目前抗纤维化疗法，包括尼达尼布和吡非尼酮，以及新近出现的化合物如nerandomilast，可以减缓肺功能下降的速度，但无法逆转已形成的纤维化或恢复正常的肺泡结构。因此，迫切需要确定疾病驱动的分子机制，并制定针对肺泡破坏和异常组织重塑基本过程的治疗策略。越来越多的证据表明，IPF不仅仅是成纤维细胞为中心的疾病，而是由重复性肺泡损伤后功能失调的上皮修复反应引发和维持的疾病。因此，阐明调节肺泡上皮稳态和再生的分子机制已成为肺纤维化研究领域的主要焦点。

在肺泡干细胞生态位中，肺泡2型（AT2）细胞作为兼性干细胞/祖细胞，负责维持肺泡稳态并在损伤后促进上皮再生。在组织损伤后，AT2细胞增殖和自我更新，随后分化为肺泡1型（AT1）细胞以恢复肺泡上皮的完整性。然而，慢性或重复性上皮损伤会损害这一再生过程，导致上皮修复缺陷、过渡性上皮状态积累、持续炎症信号传导和进行性纤维化重塑。单细胞和单核转录组分析的最新进展显著提高了对IPF肺中上皮异质性的理解，揭示了以分化能力受损、异常应激反应和衰老相关转录程序为特征的异常上皮群体的存在。特别是，表达KRT8、CLDN4和SFN等标志物的过渡性上皮细胞群被认为是适应性不良的修复中间体，在纤维化肺中积累并促进疾病进展。这些发现支持了上皮干细胞性和再生能力破坏是IPF核心致病机制的观点。多种信号通路参与调节AT2细胞命运决定和肺泡再生，包括Wnt/β-catenin、Hippo-YAP/TAZ、转化生长因子-β（TGF-β）和NOTCH信号通路。这些通路的协调调节对于维持上皮可塑性和组织修复能力至关重要。尽管取得了这些进展，但连接AT2细胞中上皮粘附动力学、干细胞性相关信号传导和适应性不良修复反应的上游分子机制仍不完全清楚。

新兴证据表明，细胞粘附相关蛋白的改变有助于衰老相关疾病（ARDs），包括肺纤维化。细胞粘附复合物不仅提供结构完整性，还作为关键信号枢纽，调节机械转导、细胞极性、增殖、分化和干细胞行为。βPAK相互作用交换因子（βPIX），由*Arhgef7*基因编码，是Rac1和Cdc42 Rho GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子，与粘着斑周转、细胞骨架重塑和细胞迁移的调节有关。βPIX在粘着斑处与GIT和桩蛋白形成多蛋白复合物，在细胞粘附结构的动态调节中发挥关键作用。在上皮组织中，适当的粘着斑重塑对于维持损伤后上皮完整性和再生反应至关重要。除了其结构功能外，越来越多的证据表明βPIX可能参与与干细胞性和组织再生相关的信号通路。先前的研究表明，βPIX直接与β-catenin相互作用，并调节结肠癌细胞中β-catenin依赖性转录活性。此外，βPIX介导的信号传导已显示可调节乳腺上皮细胞中的YAP激活，表明其在整合粘附依赖性信号与干细胞性相关通路中的潜在作用。这些观察结果表明βPIX可能作为上皮再生能力的上游调节因子。最近，有报道称βPIX表达降低可诱导培养细胞和小鼠组织中的细胞衰老，进一步将βPIX与衰老相关病理过程联系起来。鉴于上皮衰老、肺泡再生缺陷和异常上皮修复在肺纤维化中的既定作用，这些发现提出了βPIX缺失可能导致IPF发病的可能性。然而，AT2细胞中βPIX缺失是否足以诱导肺纤维化，以及βPIX如何调节肺泡上皮干细胞性和再生信号，仍然未知。

**二、研究内容概述**

本研究调查了在AT2细胞中删除βPIX基因是否可以生成鼠肺纤维化模型，并为开发新疗法提供平台。研究人员生成了AT2细胞特异性βPIX基因敲除（KO）小鼠，并使用综合方法分析了它们的肺，包括单核RNA测序（snRNA-seq）。这些小鼠自发地、进行性地发展为肺纤维化，主要特征是由于Wnt/β-catenin信号传导减少而导致AT2细胞再生和修复能力受损。对IPF患者AT2细胞的分析重现了这些观察到的异常。总之，该研究将βPIX确定为肺泡上皮干细胞性的先前未被认识的调节因子，并证明粘附相关再生信号传导的破坏足以驱动自发性纤维化肺重塑。这些发现为PF的上皮基础提供了新的机制见解，并表明恢复βPIX相关再生通路可能代表IPF的潜在治疗策略。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上。

**三、主要技术方法**

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，利用条件性基因敲除技术，通过他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统生成了AT2细胞特异性βPIX基因敲除小鼠（βPIX^fl/fl;Sftpc^Cre-ER;ROSA^R26R-EYFP），实现βPIX基因在AT2细胞中的特异性缺失。其次，应用单细胞核RNA测序（snRNA-seq）技术，对小鼠肺组织进行转录组分析，以揭示细胞异质性和细胞间通讯变化。此外，还运用了组织学染色（如Masson三色染色、免疫组化）、免疫荧光（IF）共染、蛋白质印迹、微计算机断层扫描（micro-CT）成像、3D类器官培养、邻位连接技术（PLA）、免疫沉淀（IP）和泛素化实验等分子生物学和细胞生物学技术。对于人类样本，研究人员收集了IPF患者和年龄匹配对照（ACs）的肺组织，并通过公共转录组数据和免疫荧光分析进行了验证。

**四、主要研究结果**

*βPIX在博来霉素诱导的纤维化小鼠模型中表达降低*
研究人员首先利用公开的单细胞RNA测序数据分析发现，βPIX（*Arhgef7*）mRNA在包括成纤维细胞和内皮细胞在内的多种肺细胞类型中广泛表达，但在肺泡上皮中，βPIX在AT2细胞中高表达，在AT1细胞中几乎不表达。免疫荧光（IF）分析进一步证实βPIX主要定位在前表面活性蛋白C（pro-SPC）阳性（AT2细胞标志物）的立方状细胞中。在博来霉素诱导的纤维化小鼠模型中，免疫组化显示βPIX表达显著下降，免疫共染分析表明βPIX的减少主要发生在pro-SPC+ AT2细胞中，而波形蛋白+成纤维细胞中未检测到明显变化。免疫印迹分析同样显示βPIX水平降低，伴随着纤连蛋白水平显著增加。这些结果表明，AT2细胞中βPIX的减少可能与PF的发展有关。

*βPIX基因敲除小鼠发展为进行性肺纤维化*
为确定AT2细胞中βPIX缺失与PF之间的因果关系，研究人员生成了βPIX^fl/fl;Sftpc^Cre-ER;ROSA^R26R-EYFP小鼠品系。他莫昔芬（TMX）注射可有效删除AT2细胞中的βPIX基因，并通过PCR、蛋白质印迹和免疫荧光验证。Masson三色染色和α-SMA染色显示，TMX处理后至少4周，βPIX-KO小鼠出现明显的肺纤维化，而报告小鼠无显著纤维化变化。在24周内，KO小鼠的纤维化程度进行性加重，表现为胶原沉积增加、Ashcroft评分和Sircol胶原含量显著升高。值得注意的是，KO_24小鼠再现了人类IPF的几个关键特征，包括多个蜂窝状囊肿、胸膜下区域明显纤维化，以及相对正常区域的斑片状分布但伴有肺泡壁增厚。micro-CT扫描显示KO小鼠肺密度增加、出现弥漫性混浊和囊状结构。免疫荧光和蛋白质印迹分析进一步显示KO小鼠肺组织中α-SMA和TGF-β信号传导介质（如pSMAD3和PAI-1）水平升高。这些发现表明，AT2细胞中βPIX缺失驱动了24周内进行性PF的发展。

*snRNA-seq分析揭示βPIX-KO小鼠肺中的促纤维化环境*
研究人员对WT和KO小鼠在4周和24周时的肺组织进行snRNA-seq分析。经过质量控制和批次校正后，共鉴定出32，287个基因，涵盖35，804个细胞。聚类分析将细胞分为15个亚群。在肺泡上皮细胞中，KO组中处于AT2和AT1之间过渡状态的细胞群（称为损伤相关瞬时祖细胞，DATP细胞）显著增加，并在24周时进行性扩展。通过谱系追踪实验，研究人员证实了KRT8+谱系标记细胞在βPIX缺陷小鼠中随时间累积，从KO_04组的6%增加到KO_24组的14.5%。基因表达分析显示，在KO_24小鼠中高表达的M1模块包含与PF、粘着斑、氧化应激和Keap1-Nrf2通路相关的基因。基因本体论（GO）分析证实了TGF-β产生以及伤口愈合和整合素通路相关基因的富集。在成纤维细胞亚群中，KO组中高表达Acta2、Cthrc1、Col1a1、Runx1和Pdgfrb的肌成纤维细胞群体更丰富，且纤维化相关基因（如Chl1、Kif26b和Ltbp2）表达增加。细胞间通讯分析显示，KO组中DATP细胞与肌成纤维细胞之间存在独特的TGF-β信号相互作用，而在健康WT组中不存在。此外，晚期纤维化中检测到所有细胞类型的Spp1信号传导。这些数据表明，AT2细胞中βPIX的条件性缺失创造了一个促进ECM产生肌成纤维细胞积累的环境，最终导致纤维化。

*AT2细胞中βPIX缺失诱导衰老*
先前的研究表明βPIX敲低可诱导衰老。在本研究中，对肺裂解物的蛋白质印迹分析显示，KO_04组中衰老标志物p53、p21^WAF1和γH2AX的表达高于WT_04组。衰老相关分泌表型（SASP）的关键驱动因子IL-1β、IL-6和TNFα转录本在KO_24组的AT2细胞中最丰富，而TGF-β2水平在KO组中特异性升高。在分析的上皮细胞群中，DATP细胞表现出最显著的衰老特征。有趣的是，在4周时间点，虽然snRNA-seq数据显示DATP转录特征明显，但通过免疫荧光很少检测到共表达DATP标志物KRT8和衰老标志物p21^WAF1的细胞。然而，到24周时，KRT8/p21^WAF1双阳性细胞群显著扩增，约占EYFP+且βPIX缺陷AT2细胞的30%。通过Western blotting，βPIX缺陷的AT2细胞中p53和p21^WAF1的表达均显著上调。在4-OHT诱导的βPIX^fl/fl;Sftpc^Cre-ER;ROSA^R26R-EYFP小鼠来源的AT2细胞中，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性从对照细胞的11%增加到βPIX缺陷细胞的46%。这些发现支持βPIX缺失诱导AT2细胞衰老，可能促进肺纤维化的进展。

*AT2细胞中βPIX缺失通过失调Wnt/β-catenin信号损害干细胞性和再生能力*
为探讨βPIX是否直接影响纤维化，研究人员对snRNA-seq数据进行了深入分析。利用已知干细胞性受损小鼠模型Bmi1-KO小鼠的基因表达谱进行基因集富集分析（GSEA），证实了primed AT2和DATP细胞中干细胞性显著受损，这在KO组中更为普遍。拟时间分析揭示了KO_04组中独特的“DATP桥”，而WT_04组中很少观察到。在KO组中，分支点2的基因表达模式显示两种途径：途径_1（WT和KO共有）和途径_2（KO特异性）。成熟AT1特异性基因Hopx和Pdpn在途径_2中表达下降，导致AT1分化缺陷。免疫荧光染色的定量分析显示，KO_04小鼠肺中AT1/AT2比值显著下降40%。KEGG通路和GO分析显示Wnt和Hippo信号是受损干细胞性的潜在靶通路。KO_24组中AT细胞的Wnt、Hippo和Notch信号通路基因集评分较低，而肌成纤维细胞中较高。免疫荧光分析显示，βPIX-KO小鼠AT2细胞中活性β-catenin和Axin2水平低于WT小鼠。3D Matrigel培养中，来自KO小鼠的AT2细胞产生的肺泡类器官很少，表明其干细胞潜能受损。这些结果强调了βPIX通过调节Wnt/β-catenin信号在AT2细胞干细胞性中的关键作用。

*GSK-3β抑制重新激活Wnt/β-catenin信号可减轻βPIX缺失诱导的纤维化*
鉴于βPIX-Wnt/β-catenin信号参与βPIX-KO小鼠的纤维化，研究人员评估了GSK-3β抑制的效果。GSK-3β是β-catenin稳定性的关键调节因子，促进其磷酸化和随后的泛素-蛋白酶体降解。研究人员将GSK-3β抑制剂SB216763（SB）给予βPIX-KO小鼠。Masson三色染色显示SB减轻了KO小鼠的纤维化，但对WT小鼠无显著影响。Western blot分析显示，SB恢复了KO小鼠中Wnt/β-catenin信号传导，表现为活性β-catenin、β-catenin和Axin2水平升高。在类器官培养中，GSK-3β抑制剂CHIR99021（CHIR）以剂量依赖性方式恢复了βPIX KO AT2细胞的类器官形成能力。IF分析显示，CHIR处理恢复了KO AT2细胞中β-catenin及其下游靶基因Axin2和细胞周期蛋白D1的水平，并恢复了β-catenin在细胞-细胞连接处的定位。Western blot分析确认了CHIR能逆转βPIX-KO AT2细胞中Wnt/β-catenin通路效应因子（包括Axin2、Myc和细胞周期蛋白D1）的下调。这些结果表明βPIX-Wnt/β-catenin通路在调节AT2细胞干细胞性中的关键作用，并提示使用GSK-3β抑制剂激活Wnt/β-catenin通路可能是早期PF的潜在治疗方法。

*βPIX/GIT分子凝聚体通过形成“β-catenin保护复合物”增加β-catenin稳定性*
为阐明βPIX调节β-catenin稳定性的分子机制，研究人员利用A549细胞（一种AT2样细胞系）进行了免疫沉淀实验。结果表明，βPIX与β-catenin、GIT和PAK1形成大分子复合物，该复合物还包括GSK-3β。在βPIX存在的情况下，β-catenin与PAK1和GSK-3β相互作用，PAK1介导的β-catenin丝氨酸675磷酸化（pβ-catenin^S675）占主导地位，而GSK-3β介导的S33/37/T41磷酸化（pβ-catenin^S33/37/T41）被抑制。当βPIX耗尽时，β-catenin优先与GSK-3β和GIT相互作用，几乎将PAK1排除在复合物之外，导致pβ-catenin^S33/37/T41水平升高，pβ-catenin^S675水平降低。邻位连接技术（PLA）分析证实，βPIX沉默显著减少了β-catenin与PAK1之间的PLA信号，而β-catenin与GSK-3β之间的关联没有显著变化。进一步研究发现，βPIX缺失增加了GIT与β-catenin以及GIT与GSK-3β之间的相互作用，同时减少了GIT与PAK1的相互作用。蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转了βPIX缺失诱导的β-catenin水平下降。泛素化实验表明，βPIX敲低增加了HEK293T细胞中β-TrCP介导的β-catenin泛素化水平。在分离自βPIX-KO小鼠的AT2细胞中，总β-catenin和pβ-catenin^S675水平显著降低，pGSK-3β^S9与总GSK-3β的比值下降50%，表明其激酶活性显著增加。此外，Wnt靶基因Axin2和c-Myc的表达下调。研究人员提出了一个工作模型，其中βPIX作为分子开关，通过GIT协调PAK1和GSK-3β信号之间的平衡来调节AT2细胞干细胞性。

*IPF患者AT2细胞中βPIX表达水平和Wnt/β-catenin信号均降低*
为将小鼠的发现转化为临床背景，研究人员检查了IPF患者中βPIX的表达和相关信号传导。公共转录组数据的细胞水平分析显示，IPF患者AT2细胞中βPIX mRNA表达下调，但总肺上皮细胞或成纤维细胞中无此变化。免疫荧光分析证实IPF AT2细胞中βPIX染色显著弱于年龄匹配对照（ACs）。对pβ-catenin^S675的IF研究显示，ACs的HTII-280阳性AT2细胞中pβ-catenin^S675呈强外周染色，而IPF AT2细胞中pβ-catenin^S675水平显著降低。总β-catenin和Wnt靶点Axin2的IF信号在IPF AT2细胞中也显著降低，表明Wnt信号传导减弱。有趣的是，与IPF AT2细胞中β-catenin弱表达相反，纤维化区域中胶原蛋白产生间充质细胞丰富的区域显示出强的β-catenin IF信号。这些数据支持βPIX/Wnt信号在AT2细胞中被破坏的结论。

**五、讨论总结与研究结论**

本研究报告了βPIX在肺泡上皮干细胞性中的新作用，并揭示了其缺失驱动纤维化。通过生成AT2细胞条件性βPIX基因敲除小鼠，研究人员建立了一个进行性PF的临床前模型，该模型再现了人类IPF的关键组织学特征。snRNA-seq分析揭示了处于中间分化状态的衰老肺泡上皮细胞，表明干细胞性受损。鉴于IPF AT2细胞中βPIX水平显著降低，βPIX可能有助于IPF的发展。研究人员证明，使用GSK-3β抑制剂靶向βPIX-Wnt/β-catenin信号通路是一种潜在的治疗方法。在βPIX-KO模型中，GSK-3β抑制剂有效减轻了早期纤维化，表明激活Wnt/β-catenin和Hippo/YAP等发育通路在PF早期阶段作为保护机制，维持上皮稳态并防止疾病进展。然而，由于在KO_24小鼠的肌成纤维细胞等非AT2细胞类型中观察到Wnt/β-catenin信号激活，在考虑晚期纤维化中使用GSK-3β抑制剂时应谨慎，因为这些通路的异常激活可能促进病理性重塑。研究还证明βPIX通过调节β-catenin稳定性在AT2细胞干细胞性中起关键作用，βPIX和pβ-catenin^S675主要定位于细胞外周，特别是细胞-细胞粘附处（如粘附连接），表明βPIX的空间组织是其调节AT2干细胞性的关键。此外，βPIX缺陷的AT2细胞表现出衰老，并随时间推移严重程度增加，可能通过减少自我更新能力导致AT2细胞干细胞库耗竭。βPIX缺失诱导的衰老与Wnt/β-catenin信号下调之间的相互作用可能协同影响AT2干细胞性。

总之，该研究确定了βPIX在肺泡上皮干细胞性中的新作用，并证明其缺失驱动了纤维化。作为βPIX-Wnt/β-catenin通路在PF中功能的原理验证，研究人员证明了GSK-3β抑制剂在βPIX-KO模型中的抗纤维化效果。使用该模型的进一步研究可以更深入地了解PF的潜在机制，为更有针对性的治疗方法铺平道路。