《Scientific Reports》：DeepLabCut-based automated system reveals diverse temperature tolerance among medaka strains and related Oryzias species
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温度是影响变温动物生理和行为的关键环境因子，然而传统的鱼类耐热性评估方法依赖于对丧失平衡（loss of equilibrium, LOE）的主观人工观测，限制了实验通量并引入观察者偏差。在此，研究人员开发了一套自动化温度耐受性评估系统，将基于DeepLabC
温度是影响变温动物生理和行为的关键环境因子，然而传统的鱼类耐热性评估方法依赖于对丧失平衡（loss of equilibrium, LOE）的主观人工观测，限制了实验通量并引入观察者偏差。在此，研究人员开发了一套自动化温度耐受性评估系统，将基于DeepLabCut的姿态估计与自定义图像处理算法相结合，在热应激测试中客观量化LOE发生的时间。该系统整合了区域分割和色彩变换预处理以提升关键点检测精度，随后采用结合ResNet34帧特征与关键点坐标的分类模型，无需人工观察即可客观判定LOE发生时间。与人工标注的验证比较表明，该自动化系统达到了与受过训练的研究人员之间自然变异相当的准确度，且优于无经验的人工观察者，支持其作为人工评分的一种客观、可重复替代方法的有效性。利用该系统，研究人员表征了六个青鳉品系（Oryzias latipes: d-rR/TOKYO, HB11A, OK-Cab, HO5和HdrR-II1；O. sakaizumii: HNI-II）的冷、热耐受性。冷热耐受性评估显示了品系间差异，其中HdrR-II1属于最耐冷和耐热的品系之一，而HNI-II对冷热应激的耐受性均最低。研究人员还评估了青鳉近缘种（O. sinensis, O. cabaranensis, O. curvinotus, O. luzonensis, O. celebensis和O. javanicus）以及斑马鱼（Danio rerio）的冷耐受性，揭示了与纬度分布大致对应的显著种间差异。在所测物种中分布于最高纬度的O. latipes表现出最强的冷耐受性，而O. celebensis、O. javanicus及其他热带或低纬度物种的冷耐受性相对较低。该自动化系统为温度耐受性评估提供了一个稳健、高通量的平台，结合青鳉已有的遗传与基因组资源，为阐明鱼类温度适应的分子机制奠定了基础。
**基于DeepLabCut的自动化系统揭示青鳉品系及近缘Oryzias物种的温度耐受多样性**
**一、研究背景与问题**
温度是影响鱼类生理功能和行为的重要环境因子。鱼类作为变温动物，其体内生化反应随环境温度波动而剧烈变化，各物种在进化中形成了与原生栖息地相适应的特定温度耐受范围。然而，人为气候变化正使全球水体温度持续升高，预计到2100年全球变暖幅度可达3.2℃（2.2–3.5℃），可能超过许多鱼类的热耐受极限，导致种群衰退、分布区转移甚至局部灭绝。因此，刻画鱼类温度耐受性的种间和种内变异，对于预测气候变化的水生生态后果至关重要。
目前定量鱼类温度耐受性的主要方法包括初始致死温度法（incipient lethal temperature, ILT）、慢性致死法（chronic lethal method, CLM）和临界温度法（critical thermal method, CTM）。其中CTM应用最广，以线性升温或降温至亚致死终点（如丧失平衡，loss of equilibrium, LOE）为判断指标。但传统CTM依赖人工目视判定LOE，存在观察者间差异和主观偏差，且人工连续监测耗时费力，限制了实验通量和个体/群体水平细微差异的检测。近年来，基于深度学习的行为追踪工具DeepLabCut为无标记姿态估计提供了高精度方案，但其在应用于温度耐受测定时仍面临若干挑战：难以整合实验装置结构等先验知识，多动物追踪模式在个体靠近时易发生身份交换，缺乏帧间时间连续性考虑，且不能直接提供LOE事件的行为状态分类。为此，需要针对实验情境开发任务特异的预处理、分类模型和后处理流程。
**二、研究内容与主要结论**
该研究开发了一套基于DeepLabCut的自动化温度耐受评估系统，结合ResNet34图像分类模型，实现在热应激测试中客观检测LOE时间。验证结果显示，该系统精度与训练有素的研究人员之间的自然变异相当（系统对研究者1的平均绝对误差MAE=9.1分钟，而研究者1对研究者2的MAE=9.5分钟），且优于无经验的新手观察者（MAE=11.3分钟）。利用该系统，研究人员对6个青鳉品系（Oryzias latipes: d-rR/TOKYO, HB11A, OK-Cab, HO5, HdrR-II1；O. sakaizumii: HNI-II）的冷、热耐受性进行了测定，发现品系间存在渐进式差异，其中HdrR-II1属于最耐冷和耐热的品系之一，HNI-II则对冷、热应激的耐受性均最低。进一步对6个青鳉近缘种（O. sinensis, O. cabaranensis, O. curvinotus, O. luzonensis, O. celebensis和O. javanicus）及斑马鱼（Danio rerio）进行冷耐受评估，揭示了与纬度分布大致对应的显著种间差异：O. latipes冷耐受最强，而热带或低纬度物种如O. celebensis、O. javanicus冷耐受较弱。该自动化系统为高通量温度耐受评估提供了稳健平台，结合青鳉已有的遗传与基因组资源，为阐明鱼类温度适应的分子机制奠定了基础。
**三、关键方法**
研究使用青鳉品系和相关种由日本NBRP Medaka资源中心提供（https://shigen.nig.ac.jp/medaka/）；用于种间比较的野生型青鳉和斑马鱼购自当地经销商（Fuji 3A Project, Nagoya, Japan）。所有鱼类在26℃、14小时光照/10小时黑暗条件下饲养至性成熟（至少2个月）。行为测试采用定制亚克力水箱（349×263 mm，48个隔室，每格40×40 mm），置于培养箱中；将培养箱温度从26℃快速降至2℃（冷耐受）或升至55℃（热耐受），用顶部摄像头记录视频。分析流程包括：基于HSV颜色阈值和轮廓分析实现区域分割，结合阴影去除、去色和对比度增强等颜色变换；使用ResNet50骨干（ImageNet预训练）进行七点关键点检测；LOE分类模型采用ResNet34提取帧特征（512维全局平均池化映射为64维），与关键点坐标（7×2）和置信度（7）拼接为85维特征，经全连接层输出LOE概率，再经30秒滑动平均和阈值判定确定LOE时间。统计采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验。
**四、研究结果**
**1. 建立自动化温度耐受评估系统**
研究人员比较了区域分割单动物DeepLabCut与标准多动物DeepLabCut（maDLC）在1000个训练epoch中的关键点检测误差，结果显示在所有百分位（25th, 50th, 75th）上该方法均优于maDLC。LOE检测模型结合帧特征与关键点坐标，能稳定识别从正常游动到LOE状态的转变。对50尾个体的验证表明，系统与研究者1的MAE为9.1分钟、RMSE为16.4分钟、Spearman相关系数为0.85；Bland-Altman分析显示平均偏差为?6.6分钟（95%一致性界限：?36.4至23.2分钟）。系统精度与专家间变异相当，且输出确定、完全可重复。
**2. 青鳉品系具有不同的温度耐受性**
冷耐受实验中（26℃降至2℃），各品系LOE时间（mean±SEM）为：HNI-II 86.8±3.3分钟、HB11A 89.4±5.5分钟、d-rR/TOKYO 92.3±3.7分钟、OK-Cab 101.6±2.5分钟、HO5 106.7±3.2分钟、HdrR-II1 112.3±9.2分钟。单因素方差分析显示品系间存在渐进差异，HdrR-II1与HNI-II（调整p<0.01）和HB11A（调整p<0.05）差异显著，HNI-II与HdrR-II1和HO5差异显著。热耐受实验中（26℃升至55℃），HdrR-II1最长（105.8±4.9分钟），HNI-II最短（89.1±1.2分钟），仅两者差异显著（调整p<0.01）。结果表明HNI-II对冷热应激均最不耐受，而HdrR-II1属于最耐受品系之一。
**3. Oryzias物种间冷耐受差异显著**
种间比较采用野生型O. latipes、6个近缘种及斑马鱼。O. latipes冷耐受最高（145.0±7.1分钟），显著高于所有其他物种；O. cabaranensis（106.0±9.4分钟）和O. sinensis（99.2±3.0分钟）居中；O. curvinotus（72.8±4.4分钟）、斑马鱼（66.9±3.2分钟）、O. luzonensis（58.8±3.1分钟）、O. javanicus（53.5±3.7分钟）和O. celebensis（47.7±1.9分钟）最低，彼此间无显著差异。冷耐受差异广泛反映了原生栖息地的纬度分布，但部分低纬度物种如O. cabaranensis和O. sinensis也表现出较高冷耐受，提示纬度之外的因素可能共同影响冷耐受演化。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，传统人工观察LOE耗时且存在主观性，而该自动化系统实现了与专家间变异相当的准确度和完全可重复的判定。系统早于研究者1检测到LOE约6.6分钟，可能源于分类模型训练使用研究者2的标注标准，反映了两名研究者之间LOE判断标准的细微差异。在品系比较中，成体行为学结果与先前胚胎或细胞系研究（如Hirayama等、Yoshimura等）存在差异：HNI-II在成体水平冷热耐受均最低，而HdrR-II1较耐受，说明不同生命阶段温度耐受机制可能由不同因素主导，成体LOE涉及神经、肌肉和心血管系统的整合生理反应。种间比较支持地理分布与冷耐受的一般关系，但O. cabaranensis和O. sinensis的较高冷耐受提示种系历史、纬度和局部环境条件共同塑造了Oryzias属的冷耐受演化。
研究结论：本研究中，研究人员成功地将传统上依赖主观视觉观察的LOE检测自动化。尽管研究对象为青鳉，但该系统建立在DeepLabCut框架之上，未来可有望适用于其他鱼类和动物类群。此外，青鳉品系及其近缘种为解析温度耐受的遗传基础提供了独特优势：品系间杂交可行，可进行正向遗传学分析；活体品系和基因组数据等生物资源可通过NBRP Medaka和MedakaBase等资源中心便捷获取。利用本研究所揭示的温度耐受多样性，结合青鳉系统丰富的遗传与基因组工具，有望推进对鱼类温度适应分子机制的理解。
