肽交换过程中MHC I类分子的动态状态

《Nature Communications》：Dynamic states of an MHC class I molecule during peptide exchange

　　

来源于细胞内的抗原经过加工后，由高度多态的主要组织相容性复合体I类（MHCI）蛋白呈递，从而在免疫应答过程中激活T细胞。特别是，肽交换催化剂tapasin（Tsn）在塑造最终到达细胞表面的肽抗原库中发挥关键作用。在此，研究人员利用二硫键工程结合冷冻电子显微镜（cryoEM）和分子动力学模拟，提供了肽交换过程中抗原结合槽部分塌陷的证据。形成了一种中间态，其特征是肽的N端与MHCI中保守的酪氨酸侧链之间的相互作用。在Tsn结合状态下，MHCI α₁-螺旋的解折叠与稳定的α₂-螺旋形成对比，后者通过其与交换催化剂之间的大界面的支撑而保持其天然样主要构象。预计在进化过程中，α₁-螺旋的螺旋无序倾向和骨架柔韧性有所增加，这表明多态性变异引入的动态特征可能有助于塑造呈递给T细胞的抗原库。

**肽交换过程中MHC I类分子的动态状态——论文解读**

主要组织相容性复合体I类（MHCI）蛋白将胞内来源的抗原肽呈递至细胞表面，供CD8⁺细胞毒性T细胞识别，从而介导免疫监视并清除感染或肿瘤细胞。在内质网腔侧，肽加载复合体（PLC）由抗原加工相关转运体（TAP）、伴侣蛋白tapasin（Tsn）、氧化还原酶ERp57及钙联蛋白（calreticulin）组成，其功能是将高亲和力肽装载到MHCI上。Tsn可催化MHCI上欠优肽的替换，倾向于高亲和力抗原，从而编辑最终呈递的肽库；TAPBPR（TAP结合蛋白相关蛋白）也能以类似方式催化肽交换。然而，即便存在这些编辑机制，细胞表面仍可见相对低亲和力却能引发强T细胞反应的肽，提示肽交换过程可能包含尚未被理解的结构动态。先前解析的PLC及Tsn-MHCI复合物结构大多呈现完整形成的肽结合槽，可能只是编辑过程中的快照。最近TAPBPR结合研究中观察到α₁-螺旋存在一定柔性，表明真实的肽交换可能涉及此前结构未捕获的构象变化。但MHCI、肽与Tsn三者的构象互动如何协调交换过程仍不清楚。为此，研究人员利用二硫键工程、冷冻电镜（cryoEM）和分子动力学（MD）模拟，直接探究了Tsn编辑环与MHCI α₁-螺旋之间的可塑性，并捕获了肽交换过程中的多个动态中间状态。

研究人员设计了Tsn编辑环的D12C、K16C、L18C突变，以及MHCI HLA-A2 α1-螺旋上的αY84C、αG83C、αT73C突变。通过光解释放肽段后诱导二硫键形成，发现所有配对组合均能形成二硫键——尽管在既有PLC结构中，相应残基的Cβ原子相距4.3至17.8 ?。这表明α1-螺旋在肽部分解离时具有高度构象柔性。随后，研究人员纯化了HLA-A*02:01-αY84C与Tsn-K16C二硫键连接的复合物，通过cryoEM单颗粒分析解读出四种主要构象状态。这些状态中α1-螺旋可在折叠与解折叠之间转换，肽也可呈结合或部分解离状态，且两者似乎相互独立。在所有状态下，肽前2–4个残基均与β折叠层及α2-螺旋上的保守酪氨酸（αY7、αY99、αY159、αY171）形成稳定接触，定义的“酪氨酸摇篮”可能是肽结合/解离通路上的关键中间态。进一步利用AIUPred、IUPred3和DynaMine对大量MHCI序列进行无序倾向预测，结果显示经典HLA-A、-B、-C、-G的α1-螺旋区域具有较高无序倾向，且这一特征在进化中增强，尤其在哺乳动物中明显，而硬骨鱼和鸡较低，非经典HLA-E、-F较低。研究由此提出：α1-螺旋的进化柔性可能参与塑造不同等位基因呈递的肽库，Tsn通过稳定α2-螺旋，让α1-螺旋充当灵活的肽进入/释出闸门。该论文发表在《Nature Communications》。

主要关键技术方法包括：二硫键工程设计（将特定残基突变为半胱氨酸，通过氧化还原缓冲液促进交联），结合非还原SDS-PAGE和质谱验证；单颗粒冷冻电镜（cryoEM）数据采集与三维分类、三维变异性分析，分别优化四个构象状态至3.5–3.6 ?分辨率；原子级分子动力学（MD）模拟（包括常规模拟和自适应采样，累计约144 μs和115 μs轨迹）及马尔可夫状态模型（MSM）构建自由能表面；荧光偏振（FP）法测定肽交换速率；Thermofluor热稳定性实验；以及基于序列的无序倾向预测工具AIUPred、IUPred3和DynaMine。序列数据来源于IPD-IMGT/HLA、IPD-MHC和UniProt数据库，涵盖经典、非经典HLA及多种动物MHCI。

**研究结果**：

**1. tapasin编辑环与MHCI α1-螺旋之间的二硫键形成**
通过构建Tsn编辑环（D12C、K16C、L18C）与HLA-A2 α1-螺旋（αY84C、αG83C、αT73C）的半胱氨酸突变体，实验观察到所有配对组合均可形成二硫键；MD模拟显示这种近距离接触为稀有事件，可在微秒时间尺度发生，与实验测得的数小时慢动力学一致。这证明α1-螺旋在肽部分或完全解离时具备足够的塑性来大幅移动，也解释了此前结构中相距4.3–17.8 ?的残基为何可以实现共价交联。

**2. 肽交换特性与半胱氨酸突变及二硫键形成兼容**
Thermofluor实验显示，所有pMHCI半胱氨酸变体与高亲和力肽结合后的熔解温度均在37°C以上，大多数与无半胱氨酸突变体相当。αY84C熔点较其他变体低约4°C，说明αY84与肽C端的氢键对复合物稳定性有重要贡献。荧光偏振实验显示，αY84C变体自身肽交换率略高，所有MHCI变体在Tsn（尤其是K16C、L18C）存在时肽交换均增强，表明Tsn编辑环对HLA-A2并非最优，但其催化活性仍依赖该区域的动态互动。

**3. MHCI-Tsn复合物结构揭示MHCI结合槽动力学**
对二硫键连接的HLA-A2-αY84C/Tsn-K16C复合物进行cryoEM分析，通过3D分类获得四种主要状态：状态1中α1-螺旋完整折叠且肽结合；状态2中α1-螺旋折叠但肽大部分解离（仅能追踪前两个氨基酸）；状态3中α1-螺旋未解析（α53–α80缺失）但7mer肽密度可见；状态4中α1-螺旋缺失且肽大部分解离。α1-螺旋相应区域B因子高、局部分辨率约5 ?，而α2-螺旋在所有状态下完整且分辨率低于3 ?。这说明肽C端解离触发α1-螺旋不稳定，而α2-螺旋通过与Tsn的大界面维持天然构象。

**4. 定义肽结合的中间体**
所有状态中肽的N端前1–3位残基均与β折叠层上的αY7、αY99和α2-螺旋上的αY159、αY171形成接触，构成“酪氨酸摇篮”结合模块。其中，αY171仅在状态3中与肽N端氨基形成氢键，其他状态中该侧链移开且αW51随之重排，同时P2侧链上移。将该状态与稳定pMHCI结构及TAPBPR结合的HLA-A2结构比对，发现N端接触模式高度相似，提示该中间态可能代表肽结合/解离通路上的保守步骤。

**5. α1结构域的柔韧性作为进化特征**
使用AIUPred、IUPred3和DynaMine预测分析显示，经典HLA-A、-B、-C和-G的α1-螺旋区域无序倾向显著高于α2-螺旋区域；非经典HLA-E和-HF无序倾向较低，CD1和MR1两结构域差异小。在不同物种中，硬骨鱼和鸡的α1无序倾向较低，猪、大鼠、小鼠和非人灵长类的倾向与人类相似。等位基因间存在较大差异，说明单个多态性可显著影响螺旋折叠倾向。这提示α1-螺旋柔性可能是MHCI肽结合功能的进化特征，并可能影响各个等位基因呈递的肽库范围。

**讨论总结与结论**
讨论指出，α1-螺旋能够与相距17 ?的残基形成二硫键，首先证明结合槽是动态实体。cryoEM数据进一步表明，肽C端二肽解离后α1-螺旋出现折叠与解折叠的波动，而α2-螺旋受到Tsn稳定。酪氨酸摇篮中间态在所有状态下均保守，且其构象与天然稳定结合状态相似，结合前期小鼠H-2Db动力学数据所提示的“早期遭遇复合物”，该中间态很可能位于肽结合/解离的通路上。研究人员由此提出模型：Tsn结合MHCI后稳定α2-螺旋，α1-螺旋处于动态平衡；肽的N端锚定在由αY7、αY99、αY159、αY171构成的酪氨酸摇篮上，Tsn编辑环在F-口袋处与αY84竞争肽C端，若肽C端结合不稳定，α1-螺旋难以完全折叠，肽易解离；若肽C端牢固结合，α1-螺旋闭合，MHCI-肽复合物脱离PLC并被运往细胞表面。该模型中，α1-螺旋充当柔性“闸门”，其进化上的灵活性可能决定不同等位基因的抗原肽编辑效率，并可能与ER质量监控酶UGGT1对空载MHCI的识别相关。研究结论为：MHCI在肽交换过程中经历α1-螺旋部分解折叠的动态中间状态，该状态由肽N端与保守酪氨酸侧链的相互作用介导；Tsn通过稳定α2-螺旋和与αY84竞争肽C端，促进α1-螺旋的动态波动，从而驱动低亲和力肽的解离和高亲和力肽的结合；α1-螺旋的柔性是进化上保守的特征，可能通过影响肽库的编辑广度而塑造T细胞抗原免疫应答。