优化气-液界面培养提高小鼠结肠精密切片组织的存活率和完整性

《Scientific Reports》：Optimized air–liquid interface cultivation enhances survival and integrity of mouse colon precision-cut tissue slices

　　

小鼠结肠精密切片（cPCTS）作为研究生理学、毒理学和免疫学的有价值模型。它们保留了具有生理细胞组成及完整代谢和免疫功能的三维结构。此外，cPCTS通过减少动物使用支持3R原则。本研究旨在优化cPCTS培养以维持细胞完整性、最小化损伤并增强多层肠道结构的存活率。研究人员建立了一种气-液界面（ALI）培养系统，其中cPCTS置于半透膜插入物上，培养基位于下方而上方直接暴露于空气。研究人员通过乳酸脱氢酶（LDH）检测、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色、定量聚合酶链式反应（qPCR）和免疫组织化学比较了不同氧气浓度对cPCTS存活的影响。cPCTS可保持特征性结肠结构长达120小时，最佳组织完整性至少维持96小时。与80% O2相比，大气O2条件下的培养显著降低了氧化应激和DNA损伤，表现为氧化应激相关基因表达降低和γH2AX阳性细胞减少。通过更少的TUNEL阳性细胞和更低的LDH释放证实了凋亡和细胞毒性减少。较低的氧气进一步保护了隐窝形态，增加了Lgr5和Mki67的表达，并导致更高数量的Ki67阳性细胞，表明干性和增殖能力改善。组织学分析还显示，在大气O2条件下出现了更生理性的细胞外基质重塑反应。ALI培养简化了培养基更换并便于实验操作该系统。较低氧气条件改善了cPCTS的长期存活和结构完整性，为延长机制研究和共培养研究提供了稳健的平台。

研究背景

近年来，3R原则（替代、减少和优化）在生物研究模型的建立和优化中日益重要。结肠精密切片（cPCTS）作为一种有前景的替代模型，融合了减少和优化的原则，可用于药物转运研究、食物过敏反应模型以及微生物相互作用研究。cPCTS保留了肠道各层的天然三维细胞组成及其代谢和免疫功能。其一个显著优势是从单个器官可获得大量切片，允许利用同一组织来源研究广泛的实验条件。然而，由于组织中存在多种细胞类型的多层结构，找到最优培养条件极具挑战性。主要问题是维持细胞完整性并促进组织再生，其中隐窝早期退化是关键技术难题，切片后24小时内即可观察到显著隐窝减少，且干细胞和增殖细胞死亡无法被切片自身更新。虽然添加生长因子可延长cPCTS寿命，但成本高昂。另一个可能原因是组织供氧不足，因为氧气在液体中溶解度差。气-液界面（ALI）培养技术使切片直接接触培养箱中的环境空气，从而提供必要氧气。本研究旨在优化cPCTS培养系统，以在整个培养期间维持健康和细胞完整性，最小化细胞损伤并增加多层肠道结构的存活率。该论文发表在《Scientific Reports》。

主要关键技术方法

研究人员从雌性C57BL/6小鼠（购自美国杰克逊实验室，6-8周龄，体重16-20克）获取结肠。采用振动切片机制备200微米厚的cPCTS。在ALI培养系统中，将cPCTS置于孔径0.4微米的半透膜插入物上，培养基置于下层腔室，使用Advanced DMEM/F12培养基补充特定成分，在37°C、5% CO₂条件下分别以大气氧或80% O₂培养。主要评估方法包括：乳酸脱氢酶（LDH）检测评估细胞毒性、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测细胞死亡、定量聚合酶链式反应（qPCR）分析基因表达、以及苏木精-伊红（H&E）、过碘酸雪夫（PAS）、Ki67、绒毛蛋白（Villin）和γH2AX等免疫组织化学染色进行组织学评估。

研究结果

所有肠道细胞亚型的长期保存

研究人员在80%氧气ALI条件下培养cPCTS达120小时。H&E染色显示组织架构保存完好，包括黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层。PAS染色显示杯状细胞增大，Ki67染色显示增殖细胞随时间逐渐减少，Villin表达在培养后期下降。LDH检测显示随时间推移细胞损伤逐渐增加，但所有时间点均低于死亡对照水平。qPCR分析显示肠上皮细胞和肠内分泌细胞标志物在整个过程中表达稳定或升高，而杯状细胞标志物Muc2在24小时升高后下降，干细胞标志物Lgr5和增殖标志物Mki67表达下调。结果表明cPCTS可培养长达120小时，但96小时后隐窝完整性下降。

低氧含量培养减少氧化应激损伤并提高存活率

在ALI配置中，降低氧含量至大气氧水平可限制氧化应激。qPCR结果显示大气氧条件下氧化应激标志物（Nqo1、Hmox1、Gclc）表达降低。γH2AX免疫染色显示大气氧条件下DNA损伤显著减少。TUNEL染色显示大气氧条件下细胞死亡仅轻微增加，而80%氧条件下细胞死亡显著增多。LDH检测证实大气氧条件下细胞毒性显著降低。

低氧水平更好维持细胞完整性、保持干性并诱导保护性炎症反应

ALI培养可实现实时活体成像，观察隐窝结构和黏液分泌。qPCR分析显示大气氧条件下干细胞标志物Lgr5表达显著高于80%氧条件，且随时间恢复甚至升高。增殖标志物Mki67表达稳步上升，在120小时达到0小时的3倍。Ki67免疫组化定量证实大气氧条件下阳性细胞数显著更多。H&E分析显示大气氧条件下组织完整性更好，隐窝结构保存更佳。qPCR比较炎症和纤维化标志物发现，大气氧条件下Tgfb1、Serpinh1和Il1b表达升高，促炎细胞因子Il6表达降低，Mmp3表达减少。Van Gieson染色显示大气氧条件下胶原纤维更致密有序，而80%氧条件下胶原区域更松散无序。Mmp9免疫反应性主要在80%氧条件下随时间下降。

讨论部分总结

与传统体外培养系统相比，cPCTS保留了天然组织结构和细胞复杂性，维持了细胞间和细胞-基质相互作用以及肿瘤微环境的关键特征。ALI培养克服了传统浸没培养的气体交换和机械应力限制，简化了培养基更换并实现了长期显微镜观察。氧气水平对cPCTS完整性至关重要：高氧导致隐窝退化，而降低至大气氧水平改善了增殖和干细胞标志物表达。尽管大气氧仍超过结肠组织生理氧张力，但代表了显著改进。研究中观察到的炎症和纤维化标志物变化表明模型演变为反应性促纤维化基质微环境，这可能是切片诱导损伤后的伤口愈合反应。ALI培养中氧气梯度可能导致qPCR数据和组织学结果之间的差异。

研究结论翻译

本研究表明，ALI培养为维持cPCTS活力至少96小时提供了一种有前景的方法，在大气氧条件下减少了氧化应激和DNA损伤，并提高了干性保存。该方法简化了培养基更换，无需额外固定步骤即可实现实时显微分析。通过最小化机械应力优化切割过程可减少纤维化和炎症反应，改善组织完整性。