《Antioxidants》：Urinary Extracellular Vesicle-Derived miRNAs Reveal a Coordinated Stress-Response Network Linked to Advanced Glycation End-Products in Children and Adolescents
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超加工食品的广泛消费增加了人们暴露于晚期糖基化终末产物（AGEs）的机会，AGEs是氧化应激和慢性低度炎症的关键介质。尽管AGEs与成人代谢功能障碍有关，但其在儿科人群中的早期分子相关性仍未得到充分定义。细胞外囊泡（EV）相关的microRNAs（miRNAs
超加工食品的广泛消费增加了人们暴露于晚期糖基化终末产物（AGEs）的机会，AGEs是氧化应激和慢性低度炎症的关键介质。尽管AGEs与成人代谢功能障碍有关，但其在儿科人群中的早期分子相关性仍未得到充分定义。细胞外囊泡（EV）相关的microRNAs（miRNAs）是反映系统性应激反应的稳定、非侵入性指标。本研究评估了来自I.Family队列的94名意大利儿童和青少年中尿液AGEs与尿液EV相关miRNAs之间的关联。通过荧光分光光度法对荧光AGEs进行定量，并使用下一代测序对EV富集的尿液miRNAs进行谱分析。进行了差异表达分析和多变量广义线性模型（校正年龄、性别、BMI z-score和hs-CRP）。差异表达分析显示，与低尿液AGE水平相比，高尿液AGE水平的参与者中hsa-miR-4516显著上调（倍数变化=2.31；FDR=0.024）。在多变量连续模型中，hsa-miR-4516仍然是主要的AGE相关miRNA，但在校正BMI z-score和hs-CRP后，该关联有所减弱。功能富集和网络分析强调了调控氧化应激反应、蛋白质稳态和细胞存活的通路。总体而言，尿液EV相关miRNAs可能反映对饮食AGE负担的协调生物学反应，而非作为直接暴露生物标志物，为儿童早期代谢和炎症适应提供综合、非侵入性的见解。
论文解读：尿液细胞外囊泡miRNAs与儿童青少年晚期糖基化终末产物的关联研究
晚期糖基化终末产物（AGEs）是一类由还原糖与蛋白质、脂质和核酸发生非酶促糖化及氧化反应生成的异质性生物活性化合物，主要通过外源性摄入（尤其是高温加工食品）和内源性生成两条途径在体内蓄积。现有证据表明，AGEs可通过激活其受体（RAGE）触发核因子-κB（NF-κB）和NADPH氧化酶信号通路，从而诱导氧化应激和慢性低度炎症，并与多种成人慢性疾病相关。然而，在儿童和青少年时期，AGEs的早期分子关联尚不明确。细胞外囊泡（EV）相关微小RNA（miRNA）因具有稳定性高、非侵入性检测等优势，被视为反映系统性应激反应的潜在指标。基于此，本研究利用I.Family队列的意大利分支样本，旨在探索尿液AGEs与尿液EV相关miRNAs之间的关联。
研究人员从I.Family队列中随机选取94名儿童和青少年，依据性别、体重状态和高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平进行分层设计。尿液荧光AGEs通过荧光分光光度法测定，EV富集的尿液miRNAs通过下一代测序（NGS）进行谱分析。数据分析采用差异表达分析、多变量广义线性模型（逐步校正年龄、性别、BMI z-score和hs-CRP）、部分残差分析及功能富集分析方法。差异表达分析以尿液AGEs中位数将参与者分为高暴露组和低暴露组。功能注释利用多数据库交叉验证的miRNA靶基因进行过表达分析（ORA）。主要技术方法包括：分光光度法检测荧光AGEs、NGS小RNA测序、DESeq2负二项广义线性模型、多变量协变量调整、RT-qPCR验证以及基于GO和KEGG的功能富集分析。样本队列来源为意大利I.Family研究。
结果方面，研究包含三个主要部分。
3.1 EV-miRNAs差异表达与靶标分析：基于高、低AGE组比较的未校正差异表达分析，经多重检验校正后，共有5个EV相关miRNA显著改变。其中，hsa-miR-143-3p、hsa-miR-142-3p和hsa-miR-142-5p下调，hsa-miR-4516和hsa-miR-483-5p上调。这些miRNAs既往被报道与免疫炎症调控、组织重塑、氧化应激及代谢适应相关，提示AGE暴露可能对应一个EV-miRNA相关的免疫炎症失调特征。
3.2 协变量对广义线性模型全局转录分析的影响：单变量广义线性模型再次确认hsa-miR-4516为最显著上调的miRNA（FDR=0.046；log2FC=0.62），且RT-qPCR实验验证了NGS结果。在逐步校正年龄、性别、BMI z-score及hs-CRP后，大多数miRNA与AGE的关联失去统计学显著性，提示miRNA变异主要由系统性炎症等因素驱动。hsa-miR-4516在校正后仍保留名义显著性，但部分残差分析显示其表达与hs-CRP所反映的炎症状态关系更为密切，AGE独立关联虽有保留但已减弱。此外，hsa-let-7g-5p和hsa-miR-100-5p随AGE水平升高呈显著下调趋势。
3.3 功能富集：针对hsa-miR-4516靶基因的基因本体（GO）分析显示，富集通路涉及氧化应激反应、凋亡调控、细胞增殖、蛋白磷酸化及胞内信号转导。KEGG通路分析进一步提示PI3K–AKT、MAPK和Hippo信号通路的富集。基于多候选miRNA的探索性网络分析（包括hsa-let-7g-5p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-4516）发现，其共享靶标显著富集于蛋白质稳态相关过程，包括宏自噬、蛋白质多泛素化，以及细胞衰老中DNA代谢调控通路；此外还观察到高尔基体囊泡运输相关富集，提示AGE暴露可能影响囊泡转运。
讨论部分指出，AGE与EV-miRNA关联在校正炎症和体脂指标后明显减弱，这支持一种模型：AGEs可能作为上游调节因子，触发炎症和细胞应激反应，进而间接影响EV-miRNA谱，而非直接决定miRNA表达。hsa-miR-4516的非经典生物合成特征（与核糖体RNA相关）提示其升高可能反映慢性炎症状态下翻译稳态的持续性改变。网络水平的协调富集表明，AGE暴露可能诱导一种以蛋白质毒性应激管理及糖化蛋白清除为特征的适应性反应。局限性包括样本量较小、横断面设计、未区分AGE种类、缺乏氧化应激标志物以及未对EV进行正交表征等。
研究结论部分翻译如下：本研究提供了儿童和青少年中尿液AGEs与EV相关miRNAs存在关联的新证据。在所有候选miRNAs中，hsa-miR-4516是最一致的信号，支持存在与儿童代谢应激状况相关的EV富集miRNA谱。尿液EV-miRNA谱反映了一种受限且协调的反应，表明这些标记物可能捕捉与AGE相关炎症和细胞应激反应通路相关的整合性生物适应，而非直接反映暴露水平。尽管采用探索性设计且样本量相对较小，这些发现支持EV相关miRNAs作为网络协同反映系统性应激反应的模型。在此背景下，尿液EV-miRNAs的非侵入性评估代表了早期检测儿科亚临床代谢和炎症改变的潜在手段。未来需要在更大队列中开展纵向及机制研究，整合靶向AGE谱分析和功能性miRNA分析，以验证这些发现的临床相关性，并阐明EV相关miRNAs在早期代谢风险分层和精准预防策略中的作用。
