综述：小鼠胸腺上皮微环境受Eph/Ephrin信号调控

《Cells》：The Murine Epithelial Thymic Microenvironment Is Governed by Eph/Ephrin Signalling

　　

尽管长期以来一直强调胸腺上皮细胞（TEC）-胸腺细胞相互作用对胸腺功能的重要性，但调控胸腺上皮细胞生物学的机制尚未完全阐明。在其他上皮组织中，促红细胞生成素产生肝细胞癌（Eph）受体及其配体Eph受体相互作用蛋白（ephrins）已被证明是上皮稳态的重要调节因子。因此，研究人员研究了Eph/ephrin信号在小鼠胸腺上皮细胞的组织结构、表型和功能中的作用，及其对T细胞分化的影响，历时超过20年。本综述详细描述了这些结果，得出结论：某些EphA/B受体或ephrin B的缺失会产生特异性表型，并以不同方式影响T细胞分化和免疫功能。这表明胸腺上皮基质的正确组织学结构对于正常的T细胞成熟并非必需，或者至少该过程的某些方面得以保留。

1. 引言

胸腺是初级淋巴器官，在T细胞的成熟和免疫教育中发挥关键作用。它确保对外来抗原的有效反应，同时防止自身攻击性免疫反应。因此，它被认为是中枢免疫耐受的关键组成部分。大量研究关注于理解控制胸腺细胞功能性成熟的分子和细胞机制，特别是聚焦于T细胞与胸腺上皮细胞（TEC）之间细胞相互作用的重要性。然而，胸腺基质的稳态仍未被充分理解。研究人员及其他作者已鉴定出促红细胞生成素产生肝细胞癌（Eph）受体（动物细胞中最丰富的酪氨酸激酶受体）及其配体Eph受体相互作用蛋白（ephrins）在调节包括胸腺在内的上皮组织中的作用。本综述后续章节将证明，在发育中的胸腺细胞和TEC中均有表达的Eph和ephrin B，在淋巴祖细胞定植于胸腺以及发育中胸腺细胞在整个胸腺实质中的迁移中发挥作用。这确保了不同T细胞亚群的正确拓扑定位，这些亚群主要从不同的TEC亚群接收环境指令。此外，EphB2和EphB3通过控制胸腺细胞与TEC之间的相互作用，在调节双阴性（DN, CD4^-CD8^-）细胞向双阳性（DP, CD4⁺CD8⁺）细胞区室的进展，以及DP细胞向单阳性（SP, CD4⁺CD8^-和CD4^-CD8⁺）T细胞的转化中发挥自主作用。同样，胸腺细胞成熟的改变也会影响胸腺上皮网络的建立和不同TEC亚群的出现。此外，在其他Eph或ephrin缺陷胸腺中发现的不同表型证实了这些信号通路的特异性。

2. 胸腺中A家族和B家族的Eph和Ephrin的表达

Eph和ephrin分子分为两个家族：EphA（哺乳动物中有九个成员：A1-A8和A10）和EphB（五个成员：B1-B4和B6）。此分类基于各组内分子胞外域的相似性，以及它们与配体ephrins的亲和力。Ephrins A是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，存在于细胞表面（五个成员，A1-A5），而ephrins B（三个成员，B1-B3）具有一个跨膜结构域。每个Eph受体可以结合多个ephrins，反之亦然；极少数情况下，一些Ephs（例如EphA4）可与ephrins A和B两者相互作用。大多数Eph受体是活性酪氨酸激酶，而ephrins缺乏内在催化活性，但它们结合多个细胞内靶点并与酪氨酸激酶相关联。因此，Eph/ephrin对的刺激导致Eph表达细胞（正向信号）和ephrin表达细胞（反向信号）的双向信号传导，以及细胞自主和非细胞自主的反应。对大鼠胸腺的开创性研究报告称，ephrins A主要在胸腺细胞中表达，而Eph的表达仅限于TEC。然而，EphA1和ephrinA1均存在于两种细胞类型中。此外，同一细胞类型或胸腺区室通常表达多种Ephs和ephrins。事实上，所有胸腺细胞亚群以及皮质TEC（cTEC）和髓质TEC（mTEC）亚群都表达Eph和ephrins，特别是B家族的成员。在胸腺发育早期，当TEC数量超过胸腺细胞时，表达EphB2、EphB3和ephrinB2的细胞比例达到最高值。这些值后来急剧下降，除了ephrinB2，其高水平一直维持到胚胎期（E）14.5天。因此，表达Eph和ephrin B的TEC比例高于Eph/ephrin阳性的胸腺细胞。这表明在发育早期阶段，缺乏Eph/ephrinB信号传导时，胸腺上皮会受到更严重的影响。双向信号传导能力，加上多种Ephs和ephrins之间建立的混杂相互作用，决定了大量的不同细胞相互作用，使这些分子能够参与广泛的细胞功能，包括细胞附着/脱离、迁移/趋化、拓扑定位、细胞形态、基因表达调控、细胞死亡、增殖和分化。

3. 缺乏Eph或Ephrins伴随着胸腺上皮和胸腺细胞发育的差异性改变

3.1. 缺乏Eph或Ephrins的胸腺表现出极低的细胞数量

研究人员的首次体外实验揭示了Eph受体对小鼠胸腺结构和功能的重要性。这些实验表明，EphA-Fc融合蛋白抑制大鼠胸腺细胞的分化，导致其数量减少（主要是DP细胞）和凋亡细胞比例增加。随后，研究人员研究了不同Eph缺陷小鼠的胸腺。总的来说，缺乏Eph或ephrin A或B信号传导会导致DN和DP T细胞以及TEC的凋亡增加。这通常伴随但不总是伴有增殖细胞比例的降低。然而，其他研究报告称，在EphB2或EphB6缺陷的小鼠中没有胸腺表型，这表明缺乏任何一种Eph或ephrin信号会被这些家族中其他分子介导的信号所补偿。尽管如此，在CD2启动子控制下过表达EphB6与胸腺皮质/髓质界限破坏、细胞减少和DN细胞比例增加有关。最近的研究也报告了EphB2缺陷胸腺的显著变化。实际上，对不同Ephs或ephrins缺陷突变体表型的研究揭示了每个突变体的特异性特征。无论观察到的胸腺表型如何，缺乏Eph/ephrin信号都会导致严重的细胞减少，反映了两个主要胸腺区室（胸腺细胞和TEC）及其Eph/ephrin介导的细胞相互作用的变化。在体外，添加EphA1-Fc、EphA2-Fc、EphA3-Fc或ephrinA1-Fc融合蛋白的胎胸腺器官培养物显示出绝对细胞数减少，后一种情况尤其严重，因为ephrinA1-Fc蛋白可能阻断了大部分EphA信号传导。这些处理的叶含有更高比例的凋亡细胞，主要在不成熟的CD4^-CD8⁺细胞和DP胸腺细胞区室中。然而，增殖细胞的比例没有变化。在接受可溶性EphB2-Fc或ephrinB1-Fc融合蛋白的FTOC中也观察到类似结果。然而，其他研究报告称，用ephrinB1-Fc而非ephrinB2-Fc或ephrinB3-Fc融合蛋白处理会降低细胞含量。相反，一些数据表明激活Eph/ephrin通路可降低凋亡水平。尽管如此，EphB6的交联会诱导Jurkat细胞凋亡，并且固定的EphB2-Fc和ephrinB1-Fc蛋白均可调节抗CD3抗体诱导的DP胸腺细胞凋亡，以及DP胸腺细胞与野生型TEC之间结合物的形成。为了更好地理解这些有争议的结果，重要的是要注意Eph/ephrin信号传导的效果可能取决于平板上固定蛋白的密度。可能导致EphB缺陷胸腺细胞减少的另一个因素是它们是否被淋巴祖细胞适当定植，因为它们没有自我更新的淋巴祖细胞。定植的两个重要因素是：能够定植器官的淋巴祖细胞数量，以及参与其迁移的机制的效率。来自EphB缺陷小鼠骨髓造血祖细胞的结果显示，EphB2^-/-骨髓中早期造血细胞比例降低。然而，这些细胞在胸腺播种中的作用尚不清楚。相反，在所分析的突变小鼠中，无论是胎肝CD45⁺PIRA/B⁺前体细胞，还是后期表达已知参与胸腺播种分子的骨髓祖细胞都没有显示出显著变化。尽管如此，体内和体外试验表明，淋巴祖细胞或胸腺基质中缺乏EphB会显著降低胎儿和成年小鼠的胸腺播种。综合来看，这些结果表明迁移机制比可用淋巴前体细胞的数量更重要。为了证实这一假设，研究人员分析了某些分子表达的可能变化，如趋化因子、细胞外基质成分及其受体，这些分子已知参与淋巴祖细胞在胸腺中的播种和/或发育中胸腺细胞在整个胸腺基质中的迁移和特定定位。因此，胎龄EphB2和EphB3缺陷胸腺不仅在E12.5和E13.5时表现出趋化因子CCL21和CCL25的表达降低，而且在E13.5时CXCL12的表达也降低。相反，成年EphB2缺陷小鼠表现出趋化因子、纤连蛋白和层粘连蛋白的产生减少。然而，整合素和趋化因子受体的表达没有变化。此外，基于Transwell的实验揭示，缺乏EphB2或表达EphB2^LacZ的LSK祖细胞在任何刺激存在下的迁移反应均低于WT细胞。此外，包被的ephrinB1-Fc融合蛋白对Eph的刺激也导致WT骨髓祖细胞迁移减少。其他作者强调了Eph/ephrins在外周免疫细胞迁移中的重要性。例如，ephrinB1刺激抑制趋化因子诱导的淋巴细胞迁移，而ephrinB1-Fc融合蛋白刺激外周血淋巴细胞的CXCL12依赖性迁移。此外，参与祖细胞迁移至成年胸腺的P-选择素在EphB2和EphB3缺陷胸腺的内皮细胞中表达降低，但在EphB2^LacZ胸腺中则不然。EphB2^-/-胸腺中迁移减少也与ephrinB1和ephrinB2表达降低相关。在EphB3^-/-胸腺中，减少仅影响ephrinB1表达，这支持了EphB2/ephrinB1对介导的正向信号对于胸腺内淋巴迁移特别重要的观点。尽管胸腺播种与突变胸腺的细胞减少相关，但胸腺细胞和TEC凋亡的增加似乎是更重要的因素。虽然CCR9/CCR7双敲除小鼠经历了早期T细胞祖细胞的严重耗竭，但它们在后期的阶段表现出恢复，可能是通过一些DN2和DN3前体细胞的代偿性增殖。然而，在EphB2缺陷小鼠中没有代偿性增殖，从DN3细胞阶段开始就表现出严重减少的细胞数量，这与凋亡增加（主要是DN和DP细胞）以及DN细胞比例降低相关。综上所述，所有这些因素——低数量的播种淋巴祖细胞及其成熟度降低、凋亡增加以及增殖胸腺细胞比例降低——可能是由于Dll4和IL7受体α链转录本数量减少所致。这两种分子都参与DN-DP细胞进程，也导致了突变胸腺的细胞减少。减少的胎淋巴样细胞迁入影响了未成熟MTS-20⁺ TEC的比例，进而导致总TEC数量减少。因此，TEC增殖和凋亡比例的改变也是胸腺细胞减少的原因，这影响了胸腺上皮的正常发育。因此，高比例的凋亡TEC与减少的K8⁺上皮网络和E12.5时低TEC增殖相关。这是淋巴样祖细胞播种延迟的结果，导致增殖TEC比例降低。这可能部分与FGF7及其受体FGFR2IIIb的转录本减少有关，两者都参与TEC增殖。有趣的是，在其他系统中Eph/ephrinB信号传导激活FGFR2IIIb，因此其在EphB缺陷小鼠中的缺失可以解释FGFR2IIIb转录本的减少。通过流式细胞术分析不同的TEC亚群证实了突变胸腺的成熟延迟。这些变化最终导致成年表型，其特征是由于胸腺细胞和TEC无法充分混合而导致三维上皮网络结构破坏。

3.2. 缺乏EphB2、EphB3、EphrinB1或EphrinB2导致TEC成熟和上皮网络三维组织结构的变化

这些改变包括皮质中K5⁺K8⁺胸腺上皮前体细胞的积累以及K5^-K8^-无上皮区域的出现。还出现了许多上皮囊肿，这在WT小鼠胸腺中很少见。此外，在这些突变体中明显可见凋亡TEC比例增加，主要包括未成熟的EpCAM⁺MTS20⁺细胞和EpCAM⁺Ly51⁺ cTEC。类似地，体外激活EphB或ephrinB信号传导可降低WT TEC的凋亡频率，而消除它则会增加凋亡。有趣的是，仅由EphB缺陷TEC形成的再聚集胸腺器官培养物产生的凋亡细胞比例高于由TEC和总胸腺细胞组成的RTOC，这表明Eph/ephrin介导的胸腺细胞-TEC相互作用对TEC存活至关重要。需要注意的是，所研究的EphB或ephrinB缺陷小鼠在表型上是不同的。因此，缺乏一种受体不会被另一种受体的存在所补偿。尽管这些受体的缺失被认为可由其他表达的Ephs或ephrins补偿，但表型并不重叠，而是特异且非冗余的。EphB3^-/-和EphB2/B3^-/-小鼠的胸腺包含一个大中央髓质，而在EphB2缺陷的胸腺中，胸腺髓质缩减为散布在实质中的小区域。皮质也紊乱，表现出髓质标志物K5的表达增加，并且cTEC失去了相对于结缔组织囊的典型垂直排列。EphB3^-/-皮质紊乱程度较轻，保持了平行排列的具有长细胞突起的TEC柱和高数量的K5⁺K8⁺细胞。相比之下，EphB2^-/- TEC表现出缩短的细胞突起。EphB2/B3^-/-双突变体表现出两种单缺陷小鼠的特征，包括一些严重紊乱的区域以及由具有长细胞突起的细胞组成的区域。Ephs和ephrins在其他细胞类型中调节细胞突起的发出和排列，例如神经元树突棘，以及整合素介导的细胞与ECM组分的相互作用。此外，研究人员已经证明，提供给由WT TEC和DP胸腺细胞形成的RTOC的ephrinB1-Fc融合蛋白可诱导上皮细胞突起的回缩。再次，K5⁺K8^-MTS10⁺细胞和K5⁺K8⁺MTS10⁺ mTEC存在于皮质区域。K5⁺K8⁺细胞数量增加与MTS-20⁺胸腺上皮祖细胞的高数量无关。然而，它似乎与在EphB缺陷胸腺中发现的K5⁺K8⁺MTS-20^-细胞有关，并且可能与TEC中K5表达的调控改变有关。在这些突变体中观察到的罕见K5^-K8^-MTS-20⁺细胞数量增加可能是由于MTS-20⁺上皮祖细胞中K5和K8表达下调所致。相反，在其他涉及TEC发育分子缺陷的突变体中，如Foxn1^Δ/Δ、条件性Stat3缺陷和Kremen1^-/-小鼠，也报道了高数量的K5⁺K8⁺细胞。这些分子，包括EphB，与Stat3激活相关，并间接影响转录因子AP-1的活性，后者调节角蛋白基因启动子。此外，来自hCD3εTg26和Rag2^-/-γc^-/-的成年胸腺，其表现出类似于EphB缺陷胸腺的显著T细胞分化阻滞，也显示出K5⁺K8⁺ TEC数量增加。显然，这些表型表明来自EphB缺陷胸腺的TEC在物理上与其他TEC和胸腺细胞分离。尽管如此，它们仍然表达功能性标志物，如MHCII分子。虽然EphB2和EphB3对于皮质和髓质胸腺上皮的正常发育都是必需的，但缺乏EphB2导致的髓质表型比缺乏EphB3更严重。相比之下，EphB3^-/-小鼠的胸腺皮质受到特别影响。缺乏EphB，特别是EphB3，导致从发育最早阶段开始的cTEC成熟延迟。因此，在E14.5/15.5，突变胸腺积累了未成熟的Ly51⁺CD205^- cTEC，而成熟Ly51⁺CD205⁺细胞的比例下降。由不同标志物定义的其他cTEC亚群，如CD40、MHCII和β5t，表现出相似的发育模式。EphB2^-/-胸腺中胸腺髓质的变化更为明显，表现为Claudin3,4^hiSSEA-1⁺胸腺上皮前体细胞的积累，成熟mTEC（通过UEA-1、MHCII、CD40、CD80和Aire的表达定义）的减少，以及髓质岛扩张的减弱。值得注意的是，移植到WT小鼠肾囊下的E13.5无淋巴样胎龄EphB2^-/-胸腺叶显示出比源自EphB3缺陷胸腺的更碎片化的髓质。EphB缺陷小鼠mTEC所经历的变化可能由TNF/TNFR超家族中的分子介导，特别是RANK/RANKL对。这对分子的缺失对Aire⁺ mTEC亚群有深远影响。据推测参与此调控的其他分子包括骨保护素和LTβR。为了确认这一点，研究人员刺激RANK/RANKL对以恢复突变mTEC的缺陷成熟。用激动剂抗RANK抗体处理的EphB缺陷E14.5无淋巴样胸腺叶恢复了WT比例的成熟CD40^hiCD80^hi细胞和MHCII⁺UEA-1⁺ mTEC。相反，突变胸腺显示E15.5 Vγ5⁺RANKL⁺细胞比例显著降低，这可能导致mTEC中RANK信号减弱。在EphB缺陷胸腺中经常发现大片缺乏上皮细胞标志物表达的区域，意义不明，被称为EFA。这些区域也出现在不同物种的WT胸腺中，如大鼠、小鼠和人类。EFA在EphB2/B3双KO小鼠中尤为明显，并且在参与TEC成熟分子缺陷的突变小鼠中也很显著，如Foxn1、Kremen1和Stat3。在这些区域，胸腺细胞和血管常被增大的结缔组织鞘包围。在EphB2^-/-胸腺中，EFA散布于整个胸腺实质，而在EphB3^-/-胸腺中，它们主要局限于髓质和内皮质。然而，在EphB2/B3双突变体中，EFA是从髓质扩展到皮质的大片“空化”区域。EFA在胸腺皮质和髓质中是不同的。前者包含胸腺细胞和一些带鞘的血管，而髓质包含mTEC，勾勒出含有增大血管、数量增加的ER-TR7⁺成纤维细胞、ECM组分、树突状细胞以及在某些区域有胸腺细胞的区域。这些皮质区域被描述为MHCII阴性和血管化不良的区域，含有大量胸腺细胞，这些细胞常常处于分裂状态。它们被认为是未经阳性选择随后发生凋亡的DP胸腺细胞的积聚。相反，表达几种结缔组织标志物的髓质EFA可能处于间充质状态，并经历了上皮-间充质转化，失去上皮细胞标志物并获得间充质状态。然而，研究人员并未在髓质EFA中证明与上皮-间充质转化相关的标志物的表达，包括Snail、Slug、FSP1和vimentin。此外，EphB突变体中EFA的丰富可能是由于缺乏Eph/ephrin信号传导而阻碍了胸腺细胞和TEC的相互混合和互斥，正如在其他系统中观察到的那样。EFA的可能功能在很大程度上是未知的。有人提出EFA负责产生自身反应性细胞。然而，具有大EFA的Wistar大鼠自身免疫性疾病发病率非常低，并且在EphB缺陷小鼠中未报告由CD4/CD8标志物定义的T细胞亚群比例存在免疫学异常。因此，研究人员提出这些区域本身不具有功能性免疫学意义，而仅仅反映了胸腺细胞成分之间相互作用的缺乏，以及作为胸腺细胞相互作用改变结果的凋亡TEC比例增加。尽管如此，不能排除EFA与其他模型中的其他过程有关。另一方面，在胸腺细胞或TEC中选择性删除ephrinB1和/或ephrinB2基因为胸腺上皮微环境的组织和区室化提供了有价值的见解。在胸腺细胞或TEC上特异性缺失ephrinB1和ephrinB2会导致胸腺上皮更严重和特异性的变化，影响cTEC亚群表型和位置、胸腺大小以及髓质上皮的组织结构。在未成熟胸腺细胞中删除ephrins会诱导细胞减少和T细胞成熟的部分阻断，显著影响DN细胞区室并增加DN3细胞的比例。值得注意的是，研究结果显示，TEC中ephrinB1和/或ephrinB2的缺失会影响胸腺细胞的阳性选择。这些胸腺在DP细胞亚群中具有较低比例的TCRαβ^hiCD69^hi细胞。然而，应注意，正如其他Ephs和/或ephrins所报道的那样，遗传背景有助于决定表型的严重程度。最严重和多变的表型发生在C57BL/6-CD1混合背景的突变小鼠中，而不是C57BL/6品系小鼠中。基于Ly51表达定义了cTEC的两个亚群。结论是Ly51^hi cTEC基本上对应于DN胸腺细胞的生态位，而Ly51^lo cTEC容纳DP胸腺细胞。然而，在一些ephrinB缺陷突变体中，相关分子在胸腺细胞中被删除，整个突变胸腺中显示出更均匀的Ly51表达，使得无法区分Ly51^hi细胞和Ly51^lo细胞。此外，cTEC倾向于与胸腺细胞形成圆形簇，而不是径向排列。对在TEC中特异性删除ephrinB1和/或ephrinB2基因的突变胸腺的分析揭示了cTEC亚群连续出现的延迟，每个Ly51⁺细胞亚群内MTS-20⁺ cTEC的比例与WT值相比没有变化。相比之下，大多数研究的突变体显示K5⁺K8⁺ TEC比例增加，其中一些是Ly51^hiK5⁺细胞。EphrinB1和ephrinB2也在胸腺髓质的组织中发挥重要作用。在所有研究的突变体中，髓质区域比WT胸腺更小、更致密。此外，与WT髓质相比，经常观察到大的上皮囊肿和增加的UEA-1^hiMTS-10^-细胞比例。在TEC中删除ephrinB1或ephrinB2基因的突变胸腺中，这些变化始于围产期。在胸腺细胞中删除ephrinB1或ephrinB2基因，或在TEC中删除ephrinB1基因或同时删除ephrinB1/B2基因的突变胸腺，含有大量由K5⁺K8⁺细胞有时还有MTS-20⁺细胞形成的大单层囊肿，但很少有UEA-1⁺或MTS-10⁺细胞。然而，这些突变体具有更高比例的UEA-1⁺MTS-10^-细胞，这些细胞通常形成小的囊肿，周围环绕着一薄层UEA-1^lo/-MTS-10⁺细胞。这些结果提出了几个问题。首先，为什么具有ephrinB1和/或ephrinB2缺陷的胸腺含有大量髓质上皮囊肿？构成早期胸腺原基的单层细胞在淋巴祖细胞定植后获得三维组织结构。然而，一些极化的上皮细胞仍然存在并形成上皮囊肿。在经历T细胞分化早期阻断的小鼠胸腺中，已报道了类似ephrinB缺陷胸腺中所描述的大而丰富的单层囊肿和小而致密的髓质灶。确实，强调了胸腺囊肿的存在与胸腺细胞的存在之间存在负相关。然而，研究人员未能确定胸腺细胞数量与囊肿数量或大小之间的任何相关性。相反，研究人员推测，胸腺上皮的正确分化和组织，以及避免过多的上皮囊肿，需要适当的TEC和胸腺细胞排列以及通过Eph/ephrinB相互作用的物理接触。研究结果表明，一些mTEC群体围绕代表初期髓质囊肿的“中央核心”同心排列。这些TEC群体可能包括一个表达UEA-1和MTS-10的祖细胞亚群，该亚群在胸腺细胞中删除ephrinB1和ephrinB2的胸腺中大量出现。另一方面，这种高数量髓质上皮囊肿对免疫反应性的意义仍不清楚。在涉及胸腺上皮成熟分子受损的其他实验模型中，胸腺细胞分化相当正常。类似地，在未成熟胸腺细胞中特异性删除ephrinB1和/或ephrinB2会导致DN3细胞阶段的T细胞分化部分阻断，正如研究类似突变小鼠的其他作者先前报道的那样。TEC中缺乏ephrinB1也与DN细胞阻断有关，而ephrinB1/B2基因双缺陷的突变体表现出更严重的表型，其特征在于TCRαβ⁺ T细胞略有减少以及TCRαβ^hiCD69⁺细胞减少。这表明Eph/ephrin在T细胞选择中起作用，正如之前指出的那样。然而，这些结果与突变胸腺中MHCII表达的变化无关。此外，除了细胞数量减少外，突变淋巴器官在外周T淋巴细胞比例上没有表现出显著差异。一致地，Jin等人在TEC中条件性删除EphB4的小鼠中没有发现成熟T细胞功能的显著异常。总之，胸腺细胞上ephrinB1和ephrinB2的表达将负责胸腺细胞-TEC相互作用。TEC上ephrinB1的表达对于mTEC的扩增、成熟和三维化是必要的，而TEC上ephrinB2的表达主要涉及确定髓质灶的数量和/或它们之间的距离。这可能与其参与TEC-TEC相互作用有关。

3.3. 报道的Eph或Ephrin缺陷小鼠中TEC发育的改变不会阻断T细胞分化

假设认为，适当的T细胞分化需要一个有组织的胸腺上皮。然而，许多实验模型表现出深刻改变的胸腺微环境，却没有显示出显著的胸腺细胞分化改变。对EphB或ephrinB缺陷小鼠的研究证实了这一假设。如上所述，缺乏EphB或ephrinB会导致胸腺细胞和TEC数量减少。除了EphB2和EphB3缺陷胸腺中发生的淋巴祖细胞对胸腺的定植减少外，细胞减少与DN和DP胸腺细胞凋亡增加相关。然而，很难确定细胞周期在发育中胸腺细胞中的相关性，因为在ephrinB1/B2条件性胸腺中，增殖DP胸腺细胞的比例增加，这可能是试图恢复正常的胸腺细胞含量。相反，缺乏EphB2和/或EphB3仅导致成年胸腺中总DN胸腺细胞比例增加和DN3细胞频率降低。此前，研究人员证明，使用EphA1-Fc、EphA2-Fc、EphA3-Fc和ephrinA1-Fc融合蛋白阻断EphA信号传导导致胸腺细胞比例显著降低，特别是DN和DP胸腺细胞。在体内，EphA4缺陷小鼠也表现出DP细胞比例降低和DN3胸腺细胞积累。与此同时，在ephrinB1-Fc融合蛋白存在下生长的小鼠FTOC产生降低的DP细胞比例和增加的SP细胞比例。

3.4. SCID-WT小鼠嵌合体中发生的失衡Eph/EphrinB信号传导阐明了Eph/Ephrin在T细胞成熟中的作用

确定Eph/ephrin缺陷小鼠中报道的T细胞成熟变化是由于对发育中T细胞的直接影响，还是在改变的胸腺微环境中成熟的后果，这一点很重要。由于胸腺细胞和TEC都表达Eph和ephrins，并且对Eph/ephrin信号的响应是所有信号平衡的结果，研究人员分析了SCID小鼠中EphB2和/或EphB3或WT骨髓细胞祖细胞的成熟。EphB2^-/-嵌合胸腺显示出DN细胞的大量积累，主要是DN2和DN3细胞，以及DP胸腺细胞几乎完全消失，这是由于该T细胞亚群内凋亡细胞比例增加。相比之下，EphB2^LacZ胸腺的表型比EphB2^-/-小鼠轻，表明反向信号的相关性，该信号可能通过从表达ephrinB的细胞向发育中胸腺细胞提供存活信号来控制DN-DP细胞进程。因此，Eph/ephrins对胸腺细胞成熟的调控既涉及由发育中胸腺细胞本身介导的自主控制，也涉及涉及TEC的非自主控制。EphB3似乎也参与了DN向DP细胞的进程，因为EphB3^-/-嵌合体支持所有T细胞亚群的成熟，尽管DP细胞百分比显著降低。EphB2/B3双缺陷嵌合体的表型与EphB2^-/-嵌合体非常相似。然而，仅存在EphB2不足以使正常进展至SP胸腺细胞；相反，EphB2和EphB3对于DP胸腺细胞最终成熟为SP细胞都是必需的。

3.5. EphB缺陷小鼠的免疫状况

尽管胸腺上皮微环境发生了改变并对胸腺细胞发育产生了影响，但研究人员的开创性研究表明，突变小鼠的免疫能力没有受到显著影响：解剖牺牲的突变体未发现恶性肿瘤或显著病理变化的视觉证据。突变体的脾脏和淋巴结尺寸较小，但具有正常的组织学结构，这部分反映了突变胸腺的状况。事实上，尽管突变小鼠的外周血、肠系膜淋巴结和脾脏中的细胞含量显著减少，但在EphB缺陷小鼠中，外周CD4/CD8定义的T细胞亚群比例没有显著差异。在EphB2和/或EphB3缺陷的突变胸腺中，阳性或阴性选择的胸腺细胞比例或总调节性T细胞比例没有差异。在外周，Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞的百分比没有变化。与WT值相比，突变体脾脏中Treg的比例保持不变，但在腹股沟淋巴结中略有增加。此前，研究人员分析了EphB缺陷和WT小鼠胸腺和淋巴结中SP CD4⁺细胞的TCRαβ库。除了每种突变体特有的一些差异外，在三种突变体中观察到的唯一变化是胸腺和淋巴结中Vβ3⁺CD4⁺细胞比例的增加。除了EphB或ephrinB缺陷小鼠中胸腺上皮微环境和/或T细胞发育发生的形态学和表型变化外，确定这些变化是否影响突变动物的免疫能力也很重要。研究人员最近在EphB2和EphB3缺陷小鼠中产生的胶原诱导性关节炎实验模型中检查了这些能力。如前所述，与WT值相比，突变胸腺中已知参与自身免疫的T细胞亚群几乎没有发生变化。这些包括阳性选择和阴性选择的T细胞以及Treg亚群。此外，EphB2和EphB3缺陷小鼠在睾丸、唾液腺或脂肪组织的组织切片上未显示淋巴样浸润。在WT小鼠中也观察到存在于某些突变小鼠肝脏切片中的小淋巴样积聚，如先前报道。此外，在用WT或EphB缺陷小鼠血清孵育的WT唾液腺组织切片中未检测到对自身组织抗原的反应性。EphB缺陷小鼠对皮下注射鸡II型胶原诱导的实验性关节炎反应微弱或无反应。在EphA4缺陷小鼠或缺乏ephrinB1、ephrinB2或双ephrinB1/B2的小鼠中诱导的类风湿性关节炎或实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中也观察到这种情况。各种因素可能有助于解释所有这些结果：（1）在EphB2和EphB3缺陷小鼠中观察到的低免疫反应性可能是由于中枢耐受机制缺陷，这是在改变的胸腺微环境中T细胞成熟的结果，尽管T细胞发育中观察到的变化很少。在EphB缺陷胸腺中，如果有足够数量的胸腺细胞-TEC相互作用发生，或者存在其他抗原呈递细胞，如树突状细胞亚群、B淋巴细胞或髓质成纤维细胞（它们也参与T细胞选择），则可能发生适当的胸腺选择。然而，根据研究结果，只有浆细胞样树突状细胞的比例在缺陷胸腺中增加，而这些细胞的免疫功能尚有争议。另一方面，参与胸腺中自身反应性T细胞阴性选择的mTEC表达编码外周组织抗原或组织特异性抗原的转录本。Aire诱导大量PTA转录本的表达，而被描述为Aire^loFoxn1^lo mTEC和外周细胞类型的“杂交”细胞的所谓胸腺模拟细胞，在其染色质景观和转录组谱中模仿外周细胞，并在胸腺内表达组织特异性抗原。进一步的研究表明，这些细胞构成了一个Aire后的胸腺区室，其特征是Aire和MHCII表达下调。它们包括簇细胞、微皱褶细胞、纤毛细胞、角质形成细胞、离子细胞、肌细胞、神经内分泌细胞、杯状细胞、基底细胞、肠细胞/肝细胞和Ptf1a⁺胰腺模拟细胞。事实上，跨物种的模拟细胞类型存在显著的转换，尽管一些模拟细胞是物种特异性的。因此，胸腺模拟细胞代表了Aire介导的PTA表达的一种补充机制，为胸腺微环境提供外周抗原。尽管如此，关于模拟细胞在人类免疫耐受中作用的证据只是间接的，并且没有关于Eph或ephrin缺陷胸腺中这些细胞亚群状态的已发表数据，这个问题接下来将得到解决。（2）有限的反应性也可能是外周T细胞状况的结果，这些细胞直接负责关节炎病变。EphB6的缺陷与淋巴因子分泌受损、T细胞增殖和迟发型皮肤超敏反应有关，尽管胸腺T细胞亚群比例正常。在其他模型中，ephrinB1/B2双KO小鼠中EAE和CIA发展的改善与Th1和Th17细胞缺陷有关。结合研究人员自己的结果，这些数据表明通过EphB2、EphB3、ephrinB1和ephrinB2的信号传导对于充分的免疫反应是必需的。在研究人员的模型中，暴露于鸡II型胶原的非免疫小鼠的引流腹股沟淋巴结，在EphB3^-/-小鼠中表现出产生较少反应性T细胞和较高比例Treg细胞的趋势，而非免疫的WT小鼠则不然。在EphB2和EphB3 KO小鼠中也观察到产生IL4的细胞百分比增加。IL4似乎在决定CIA是否发生中起关键作用，正如在其他研究中观察到的那样，并且其给药可减少临床参数以及骨侵蚀和关节损伤。EphB2^-/-小鼠对胶原刺激的反应性降低，抗体产量低，腹股沟淋巴结T细胞对抗CD3和抗CD28抗体刺激的增殖减少。另一方面，EphB3^-/-小鼠也表现出反应性降低。特别是，腹股沟淋巴结T淋巴细胞在Transwell试验中向CXCL12迁移的能力极小。这些结果表明，EphB缺陷小鼠在免疫学上表现良好，如不存在自身反应性淋巴样浸润和自身抗体。然而，外周T细胞功能特性的改变，影响抗原反应性或细胞向炎症组织的迁移，阻碍了关节炎的进展。

3.6. EphA4^-/-胸腺的表型加强了Eph/Ephrin介导效应的特异性以及这些分子在胸腺细胞-TEC相互作用中的作用

为了更详细地理解Eph/ephrin信号传导对胸腺生物学的重要性，研究人员将在EphB或ephrinB缺陷胸腺上报道的结果与研究EphA4^-/-小鼠获得的结果进行了比较。对EphA4^-/-小鼠表现的胸腺表型的分析支持了上述A和B家族Ephs和ephrins在决定胸腺结构和功能方面的独特特异性。然而，更重要的是，它提供了关于Eph/ephrin介导的胸腺细胞-TEC相互作用在控制胸腺生物学中重要性的显著信息。与EphB或ephrinB缺陷胸腺（显示T细胞成熟变化很小）相比，EphA4^-/-胸腺的数据显示了T细胞祖细胞分化的早期阻断。这导致DN3胸腺细胞的积累。值得注意的是，这种改变的T细胞分化发生在皮质极度缩小、塌陷的胸腺中。此外，在存在EphA4缺陷胸腺基质的情况下，WT骨髓淋巴前体细胞经历了深刻改变的T细胞发育。最近，研究人员根据DP胸腺细胞含量对EphA4^-/-胸腺进行了分类。有趣的是，一些突变小鼠含有高比例的DP细胞，这与WT胸腺非常相似。其他人则表现出低比例的DP胸腺细胞。在中间条件下，DP细胞区室含有50-70%的DP胸腺细胞。含有高比例DP胸腺细胞的EphA4^-/-小鼠胸腺没有表现出DN细胞百分比的变化，但显示出阳性选择的胸腺细胞和Treg细胞比例降低，在CD69^-CD62L⁺细胞亚群比例中没有观察到变化。总之，这些发现可以解释在这些DP^hi突变体中观察到的SP胸腺细胞减少。含有低比例DP细胞的EphA4^-/-胸腺特别令人感兴趣。这些胸腺显示出增加的DN3细胞比例和低数量的DN4胸腺细胞。DP^lo和DP^Int胸腺都含有增加的阳性选择胸腺细胞和Treg细胞比例，在阴性选择的T细胞比例中没有观察到变化。这些结果，连同成熟CD69^-CD62L⁺ CD4⁺/CD8⁺细胞的积累，促进了这些缺陷胸腺中SP细胞百分比的增加。然而，没有证据表明EphA4/ephrin信号传导与胸腺选择之间有直接关系。尽管如此，EphA4 KO小鼠在诱导EAE时表现出较不严重的自身免疫反应。此外，参与胸腺细胞选择的转录因子Krox20/Erg2B调节EphA4表达，而ephrinA-Fc融合蛋白和抗CD3单克隆抗体抑制CD69表达。更重要的是，EphA4缺陷小鼠中T细胞成熟的变化与胸腺上皮的显著改变密切相关。组织学上，特别是在DP^lo胸腺中，胸腺皮质上皮的塌陷与Ly51⁺UEA-1^- cTEC比例增加和Ly51^-UEA-1⁺ mTEC比例降低相关，这可能是由于MHCII^loCD80^-未成熟mTEC的成熟缺陷。EphA4^-/- cTEC比例的增加填补了因缺乏DP胸腺细胞而产生的空白皮质区域，导致胸腺皮质塌陷。同时，尽管成熟mTEC数量减少，但胸腺髓质增大，这是由于阳性选择的SP胸腺细胞和Treg细胞比例增加，而阴性选择保持不变。ECM组分及其受体确实发生了变化，这些变化影响细胞粘附，而非由趋化因子及其受体介导的胸腺细胞迁移。

4. 具有深度改变胸腺基质的小鼠是否仍能具有免疫能力？

如上所述，科学文献中有许多例子表明，由于不同的过程、分子或信号通路导致胸腺上皮的改变，从而引起胸腺细胞-TEC相互作用完全或部分缺失，但并不一定导致T细胞亚群表型的变化或中枢耐受的崩溃。换句话说，一些作者提出，只需要少量的TEC就足以促进胸腺细胞和TEC之间必要的相互作用，以支持淋巴细胞的成熟。在这方面，所有关于Eph/ephrins和胸腺组织结构的研究都得出了一个明确的结论：胸腺细胞和TEC之间的相互作用对于器官正常的免疫功能至关重要。然而，一个看似改变的胸腺微环境是否仍能支持关键的胸腺功能，如中枢免疫教育？换句话说，具有深度改变胸腺微环境的小鼠是否具有免疫能力？为了验证这一假设，研究人员研究了含有不同数量E14.5胸腺基质细胞的RTOC中的T细胞成熟。移植到Foxn1^-/-小鼠肾囊下一月后，由1-0.5×10⁶个WT TSC建立的RTOC增长了约5-7倍，而那些含有较少TSC的RTOC增长显著较少，并表现出降低的DP胸腺细胞比例和增加的TCRαβ^hi细胞频率。

5. 结论与展望

这些结果都证明了Eph受体家族及其配体ephrins在组织小鼠胸腺上皮基质和胸腺细胞发育中的重要作用。这些分子家族不同成员的不同功能支持了该过程的特异性。EphB2和/或EphB3或ephrins B的缺失会导致胸腺上皮基质的显著改变。然而，这并不会阻止T细胞分化，后者在胸腺和外周淋巴器官中仅表现出轻微的改变。相比之下，EphA4信号的缺失会阻断T细胞分化，导致DP胸腺细胞比例不一以及胸腺上皮皮质的组织学塌陷。这些结果在一定程度上质疑了胸腺基质正确的组织学结构对于支持适当的T细胞成熟，或至少保留该过程的某些方面是否是必需的。另一方面，尽管关于不同Ephs和ephrins在组织淋巴环境以及T细胞发育和功能中的作用仍有许多问题，但三个问题对于进一步分析似乎尤为重要：(a) 必须检查Eph或ephrin缺陷小鼠中胸腺髓质模拟细胞的状况。这些细胞参与胸腺内PTA的呈递，它们的改变可能有助于解释胸腺教育的某些缺陷。(b) 应检查具有不同Eph或ephrin家族分子缺陷的突变小鼠中胸腺细胞和外周T淋巴细胞的免疫能力，而不仅仅是其比例或表型的变化。(c) 存在这样一种可能性，即足够数量的TEC-胸腺细胞相互作用允许正常的免疫功能，或独立于胸腺上皮的组织学结构部分保留某些能力。研究人员报道的使用体内移植的、由不同数量WT TSC形成的RTOC获得的结果，需要通过研究由EphB缺陷胸腺基质细胞生成的RTOC的行为来确认。