《Foods》：Highly Sustainable Plant and Yeast Hydrolysate-Based Alternative for Basal Medium Supports Long-Term In Vitro Propagation of Bovine Satellite Cells
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培养肉的生产将需要大量细胞培养基，这带来了高成本和基于蛋白质的组分以及基础培养基中其他成分可持续性有限等挑战。迄今为止，大多数研究集中于替代和优化基于蛋白质的培养基组分，并在降低生长因子和血清白蛋白相关成本方面取得了显著进展。然而，含有氨基酸、维生素、碳源和微
培养肉的生产将需要大量细胞培养基，这带来了高成本和基于蛋白质的组分以及基础培养基中其他成分可持续性有限等挑战。迄今为止，大多数研究集中于替代和优化基于蛋白质的培养基组分，并在降低生长因子和血清白蛋白相关成本方面取得了显著进展。然而，含有氨基酸、维生素、碳源和微量元素的基础培养基同样至关重要。尽管已有一些优化其组成的工作，但使用化学全定义混合物的环境影响仍然相当大，且成本降低颇具挑战。在本研究中，研究人员引入了一种利用部分水解的植物和酵母生物质混合物生产基础培养基的新方法。研究结果表明，水解物基础培养基（HBBM）在牛卫星细胞的增殖和分化过程中，其表现与化学全定义基础培养基相当。此外，研究人员进行了比较生命周期评估，以探讨用HBBM替代化学全定义培养基的环境影响。分析显示，环境冲击具有潜在的降低空间，凸显了基础培养基配方作为影响生态可持续性的关键因素的相关性。
**论文解读：基于植物与酵母水解物的基础培养基替代策略及其在牛卫星细胞长期体外扩增中的应用与可持续性评估**
**1. 研究背景与问题**
培养肉（cultured meat）被认为是未来可持续肉类供应的重要方向，但其商业化面临生产成本高、安全性及高能耗等挑战，其中细胞培养基成本是主要瓶颈之一。传统细胞培养基包含5%–20%的胎牛血清（FBS）以及化学全定义的基础培养基（basal medium），后者由碳源、氨基酸、维生素和矿物质等组成。过去十年，细胞农业领域的研究主要集中于替代FBS，并取得了显著进展，例如开发了无血清培养基配方。然而，对基础培养基本身的关注相对不足。常用的基础培养基如DMEM/F12为化学全定义配方，其单一组分的来源和生产过程对最终产品的价格与环境足迹影响深远。氨基酸、重组蛋白、维生素和碳源等成分的制造依赖复杂的生化过程、大量原料提取和高能耗，导致显著的环境负担。此外，现有生命周期评估（LCA）显示，培养基是培养肉生产中环境热点的主导因素。因此，亟需探索新的基础培养基生产途径，以降低成本和环境影响。植物和微生物来源的水解物富含寡肽、游离氨基酸、维生素、糖类和矿物质等营养成分，且成本较低、生产过程相对简单，并可通过利用农业工业废弃物（如啤酒废弃酵母）实现循环经济。然而，迄今大多数研究仅将水解物用作FBS的替代物或添加剂，尚未有研究尝试以水解物完全替代化学全定义的基础培养基。基于此，研究人员假设水解物可完全替代化学全定义基础培养基，并开展了系统的评估。
**2. 研究目的与研究假设**
本研究的核心目标是评估以植物来源（小麦、水稻、大豆）水解物和酵母（酿酒酵母 *Saccharomyces cerevisiae* 和巴斯德毕赤酵母 *Pichia pastoris*）自溶物完全替代化学全定义基础培养基（如DMEM/F12）的可行性，同时保持其他补充物（如B8添加剂、人血清白蛋白HSA等）不变。研究人员还从可扩展性、成本、批次间变异和杂质等方面对替代方案进行了评价，并通过比较生命周期评估探讨其生态效益。研究假设是：水解物可以作为化学全定义基础培养基的完全替代品。
**3. 研究实施与主要技术方法**
研究使用了以下关键方法：（1）**水解物制备**：植物水解物由NaTurtle公司采用基于已发表方案的专有工艺生产，来源于小麦、水稻和大豆；酵母自溶物则通过标准自溶流程制备，酿酒酵母来自奥地利格拉茨Sudhaus啤酒厂，巴斯德毕赤酵母菌株CBS7435 *ku70-his4-HAC1*来自格拉茨工业大学分子生物技术研究所。（2）**细胞培养模型**：从三头19月龄阉割西门塔尔公牛（*Bos taurus*）的半腱肌中分离牛卫星细胞（bovine satellite cells, BSCs），采用标准方案，并验证Pax7标记确认细胞身份。（3）**增殖与分化评估**：采用Presto Blue法检测代谢活性，Hoechst 33258法量化DNA含量，通过计算群体倍增数和倍增时间评估长期增殖能力，并通过融合指数评估分化能力。（4）**成分分析**：由Eurofins公司分析水解物及废培养基中的氨基酸、维生素、有机化合物、金属离子等成分，采用定量NMR和LC-MS/MS交叉验证。（5）**生命周期评估**：依据ISO 14040/44标准，采用Environment Footprint 3.1方法，评估气候变化、水资源消耗、土地占用和资源消耗四项指标，以每升基础培养基为功能单位，系统边界为“摇篮到大门”（cradle-to-gate）。
**4. 主要研究结果**
**4.1 植物和酵母生物质高营养细胞裂解物和水解物的生产**
与NaTurtle公司合作，从小麦、水稻和大豆成功制备了蛋白质水解物，SDS-PAGE确认了高效蛋白水解。同时从两种酵母制备了细胞提取物和自溶物。酿酒酵母自溶物的蛋白含量可重复地高于巴斯德毕赤酵母自溶物，表明需要针对不同酵母物种优化方法。
**4.2 水解物对牛卫星细胞增殖的短期毒性测试**
在无血清培养基B9+MC中补充不同浓度水解物。酿酒酵母自溶物在高于0.025 g/L时显示轻微毒性，低于该浓度时略有增殖促进；巴斯德毕赤酵母自溶物在0.01–0.05 g/L范围内显著促进增殖；小麦（5 g/L）和大豆（0.2及5 g/L）水解物在较高浓度下显示出显著的增殖诱导效应，且所有测试浓度均无负面效应。
**4.3 酵母和植物水解物完全替代DMEM/F12的短期测试**
单用水解物（无论酵母或植物来源）完全替代基础培养基未能成功。随后将效果最好的0.025 g/L酵母自溶物与不同浓度的植物水解物组合。结果显示，0.025 g/L *P. pastoris* 自溶物与大豆、小麦或水稻水解物的组合在短期增殖实验中可完全替代DMEM/F12，其中大豆组合表现最佳。
**4.4 完全替代DMEM/F12的长期测试**
最佳组合在六代长期培养中进一步验证。*P. pastoris*+大豆组合表现与DMEM/F12相当，但长期效率略低；添加甲基纤维素（MC）后性能略有改善。*S. cerevisiae*水解物总体表现逊于*P. pastoris*水解物。在*S. cerevisiae*基础培养基中分化的BSC融合效率明显低于DMEM/F12，而在*P. pastoris*水解物培养基中形态更接近对照。此外，含植物水解物的培养基中细胞出现更多的圆形和半贴壁状态，提示可能存在贴附问题，MC补充可缓解大豆水解物培养基中的这一效应。
**4.5 植物水解物添加时间对HBBM中BSC活力的影响**
鉴于植物水解物可能含有的植物白蛋白残留肽段具有包被能力而干扰细胞贴附，研究人员将植物水解物的添加延迟至传代后24小时。该策略对细胞活力有显著积极影响（尤其对水稻水解物），并提高了群体倍增数（水稻），但大豆未出现该效应。分化形态和融合指数在四个代次内与DMEM/F12无显著差异。
**4.6 水解物完全替代DMEM/F12的含量分析**
对*P. pastoris*和*S. cerevisiae*自溶物及大豆水解物的氨基酸、维生素、糖和矿物质组成进行了分析，并与DMEM/F12比较。实验室规模的*S. cerevisiae*自水解批次间变异相当大（约30–40%），表明需要方法优化和标准化。
**4.7 水解物游离氨基酸含量分析**
最佳工作组合（0.1 g/L大豆水解物+0.025 g/L *P. pastoris*自溶物）中氨基酸浓度总体远低于DMEM/F12。所有牛必需氨基酸在两种酵母自溶物中均存在，但*S. cerevisiae*自溶物中氨基酸浓度更高而其效果更差，表明增殖效率差异并非由游离氨基酸引起。废培养基中氨基酸浓度反而高于新鲜培养基，可能归因于水分蒸发或细胞外肽酶活性。补充推测的瓶颈氨基酸（Arg、His、Met、Trp、Cys和Gln）后，酵母自溶物仍远逊于DMEM/F12，进一步支持氨基酸组成并非HBBM的关键瓶颈。
**4.8 水解物维生素含量分析**
在六种必需维生素（B1、B2、B3、B5、B6、B9）中，B2和B9在*P. pastoris*自溶物和大豆水解物中均低于检测限；非必需的B7和B12同样未检出。但正常血液中这些维生素的生理浓度低于DMEM/F12中的使用浓度，这解释了BSC仍能正常增殖和分化的现象。
**4.9 水解物中有机化合物和金属离子含量分析**
检测到甲酸和乙醇两种潜在毒性物质，但浓度远低于哺乳动物细胞毒性水平。在大豆水解物中检测到一定浓度的Ala-Gln（谷氨酰胺的稳定替代物），这可能解释了植物水解物与酵母提取物组合时的增效作用。未检测到重金属污染。
**4.10 生命周期分析**
与DMEM/F12相比，HBBM在四项环境指标上均显示环境优势：气候变化影响降低约3.5倍（CO?当量/升），水资源消耗降低约1.6倍，土地占用降低约1.4倍，资源消耗降低约5.6倍。主要贡献来自HBBM中无机盐和氨基酸的低占比，而“其他化合物”（主要为葡萄糖）成为主要贡献者。
**5. 讨论与结论**
研究人员认为DMEM/F12与HBBM在支持BSC增殖和分化方面表现相当。初步估算显示，HBBM的成本贡献约为每升7欧分，而DMEM/F12的散装价格约为每升2.5欧元，可实现约36倍的成本降低。比较LCA表明基础培养基配方是影响培养肉系统环境表现的关键因素。未来需进行技术经济评估，整合工业一级数据，扩展系统边界，并优化水解物制备方法以减少维生素损失、控制批次间变异、明确批次释放标准、进行安全性研究。同时，水解物缺乏碳源是一大局限，建议探索微藻等低碳足迹的葡萄糖替代来源。总体而言，HBBM为降低基础培养基成本和增强可持续性提供了极具前景的方向，但在用于培养肉生产前仍需更多优化、安全验证和规模化验证。
**研究结论**
本研究表明，植物和酵母水解物组合（例如0.1 g/L大豆水解物与0.025 g/L *P. pastoris*自溶物，补充葡萄糖并用0.1 g/L甲基纤维素稳定）作为基础培养基，可在短期和长期实验中支持牛卫星细胞的增殖和分化，其表现与化学全定义的DMEM/F12相当。初步评估显示HBBM在经济性和环境友好性方面具有显著优势。然而，在将其用于食品工业之前，该技术需要进一步优化、全面测试安全性，并扩大至中试规模，同时开展综合技术经济评估。
