牛蒡子苷元与姜黄素联合处理诱导前列腺癌细胞氧化还原应激、代谢应激、AMPK磷酸化及凋亡信号

《Nutrients》：Combined Arctigenin and Curcumin Treatment Induces Redox and Metabolic Stress, AMPK Phosphorylation, and Apoptotic Signaling in Prostate Cancer Cells

　　

背景/目的：前列腺癌仍然是男性癌症相关死亡的主要原因。牛蒡子苷元（ATG）和姜黄素（CUR）具有抗癌活性；然而，其联合处理对氧化还原应激和代谢应激的作用仍未完全阐明。本研究探讨了ATG和CUR联合处理在前列腺癌细胞中的抗癌作用。方法：研究人员用ATG和CUR单独或联合处理PC-3前列腺癌细胞和正常人前列腺上皮（HPrEC）细胞，评估了细胞活力、联合指数、活性氧（ROS）、GSH/GSSG比值、ATP水平、AMPK磷酸化和凋亡相关反应。使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）检查氧化应激的贡献，并在三维（3D）球状体中进一步评估处理效果。结果：ATG和CUR联合处理在PC-3细胞中比在HPrEC细胞中产生更大的生长抑制和凋亡反应，并且在测试条件下对PC-3细胞具有协同作用。联合处理增加ROS，降低GSH/GSSG比值和ATP水平，增加AMPK磷酸化，并增强凋亡相关反应。NAC减弱了ROS积累，部分恢复了细胞活力和ATP水平，并降低了PC-3细胞中caspase-3/7活性。在3D PC-3球状体中，NAC也部分恢复了活力和ATP水平，并减弱了cleaved caspase-3和cleaved PARP的增加。结论：ATG和CUR联合处理在PC-3细胞中诱导氧化还原和代谢应激并增强凋亡反应，在HPrEC细胞中作用较弱。NAC挽救实验支持氧化应激的功能性贡献。这些发现支持ROS相关的代谢应激、AMPK磷酸化和凋亡信号之间的关联，而精确的因果关系需要进一步研究。

前列腺癌是全球男性第二常见的恶性肿瘤，晚期及转移性前列腺癌因疾病进展、复发及最终发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）而面临重大临床挑战，现有治疗策略的长期疗效常因获得性耐药、肿瘤异质性和治疗相关毒性而受限。代谢重编程是前列腺癌进展的重要特征，使癌细胞能够在肿瘤微环境中适应氧化应激、营养限制和能量需求波动，并维持细胞生物能量学和氧化还原平衡。天然植物化学物因能同时调控氧化应激、炎症、线粒体功能、细胞代谢和程序性死亡等多条信号通路且对正常组织毒性较低而成为癌症防治的研究热点。牛蒡子苷元（ATG，来源于牛蒡的二苄基丁内酯木脂素）和姜黄素（CUR，来源于姜黄的多酚二芳基庚烷类化合物）均具有抗氧化、抗炎、抗增殖和促凋亡活性；二者在氧化还原调节和线粒体能量代谢方面具有重叠效应，但涉及部分不同的分子靶点，这种机制互补性为联合用药提供了理论依据。然而，ATG和CUR联合处理对前列腺癌氧化还原稳态和能量代谢的影响仍不清楚，氧化应激、ATP耗竭、AMPK激活与线粒体凋亡之间的关系也尚未明确。研究人员假设联合处理能增强前列腺癌细胞的氧化和代谢应激，且ROS生成对生长抑制和凋亡反应具有功能性贡献，并对此进行了系统验证。该研究发表在《Nutrients》。

主要技术方法：该研究使用人前列腺癌PC-3细胞（来源于ATCC）和正常人前列腺上皮HPrEC细胞（来源于Lonza），采用MTT法和台盼蓝排斥实验检测细胞活力；Chou-Talalay联合指数（CI）法评估药物相互作用；DCFDA探针检测细胞内ROS；GSH/GSSG-Glo试剂盒检测氧化还原状态；CellTiter-Glo法检测ATP水平；Western blot检测AMPK磷酸化及凋亡相关蛋白；Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡；并在三维（3D）超低吸附球状体模型中验证处理效应，同时使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）进行抗氧化挽救实验。

结果：
3.1 ATG和CUR对正常和前列腺癌细胞活力的影响：MTT和台盼蓝实验显示，40 μM浓度下HPrEC细胞活力保持约90%，而PC-3细胞出现可测的生长抑制，故选定40 μM进行后续机制实验。
3.2 选定浓度下的药物相互作用和抗增殖作用：CI分析显示PC-3细胞中平均CI为0.816±0.032，提示协同作用；HPrEC中平均CI为1.088±0.191，接近相加。结晶紫染色显示联合处理使PC-3细胞相对密度降至对照的57.5%，显著强于单药。
3.3 联合处理改变PC-3细胞氧化还原和能量状态：联合处理使PC-3细胞ROS升至对照的168.1%，GSH/GSSG比值降至约56%，ATP降至61.1%，而HPrEC变化较小。
3.4 联合处理增强PC-3细胞凋亡：Annexin V/PI检测显示联合处理使PC-3细胞总凋亡率从2.44%升至45.35%，显著高于HPrEC的19.05%。
3.5 联合处理与AMPK磷酸化和凋亡相关变化相关：Western blot显示PC-3细胞p-AMPKα（Thr¹⁷²）达对照的约3.5倍，cleaved caspase-3和cleaved PARP分别达4.8倍和7.1倍，caspase-3/7活性增至197.9%。
3.6 联合处理对PC-3球状体的生长抑制大于HPrEC球状体：PC-3球状体直径从177.98 μm降至96.45 μm，投影面积从25,481 μm²降至7,341 μm²，活力降至55.5%，ATP降至59.7%。
3.7 三维球状体中联合处理与AMPK磷酸化和凋亡相关变化相关：p-AMPKα升至约2.9倍，cleaved caspase-3和cleaved PARP均升至约5.2倍，HPrEC球状体变化轻微。
3.8 NAC在二维培养中减弱ATG/CUR诱导的变化：NAC预处理使PC-3细胞活力从52.9%恢复至75.5%，ROS从321.1%降至177.6%，ATP从53.8%恢复至78.4%，caspase-3/7活性从199.1%降至142.1%。
3.9 NAC在三维球状体中减弱生长抑制和凋亡信号：NAC使PC-3球状体活力从56.8%恢复至73.1%，ATP从59.4%恢复至78.6%，cleaved caspase-3和cleaved PARP分别从5.15倍和4.97倍降至2.35倍和2.43倍。

讨论部分总结：PC-3细胞对联合处理的敏感性显著高于HPrEC细胞，这可能与癌细胞代谢重编程、基础ROS水平较高且更依赖抗氧化防御系统有关；3D球状体因存在氧、营养、代谢物和药物渗透的空间梯度，可放大癌细胞与正常细胞间的应激耐受差异，但该解释仍属推断，氧和营养梯度等参数并未直接测量。NAC仅部分挽救细胞活力和ATP水平，提示ROS是重要贡献因素而非唯一介导机制，ATG/CUR联合处理可能同时涉及ROS非依赖途径。研究存在局限性：仅使用PC-3一种癌细胞系，未对AMPK进行药理学抑制或遗传学操作，缺乏体内研究验证，3D模型也不能完全重现体内肿瘤微环境的复杂性。

研究结论部分翻译：总之，在测试实验条件下，牛蒡子苷元（ATG）和姜黄素（CUR）联合处理在人前列腺癌PC-3细胞中比在人正常前列腺上皮（HPrEC）细胞中产生显著更强的生长抑制和凋亡反应。这些反应与活性氧（ROS）积累增加、氧化还原平衡破坏、细胞ATP水平降低、AMPK磷酸化增加和凋亡相关信号增强相关。重要的是，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理减弱了ROS积累，部分恢复了细胞活力和ATP水平，并降低了PC-3细胞中caspase-3/7活性。在3D球状体模型中，NAC预处理也部分恢复了球状体活力和ATP水平，并显著减弱了ATG/CUR诱导的cleaved caspase-3和cleaved PARP增加。这些挽救实验为氧化应激对治疗反应的重要贡献提供了功能性支持。2D培养中观察到的差异反应在3D球状体模型中同样存在；然而，这些发现应在更复杂的体外系统背景下解读，而非作为直接的转化验证。总体而言，目前的研究结果支持以下模型：ATG和CUR联合处理后，氧化和代谢应激与AMPK磷酸化增加及凋亡反应增强相关。尽管NAC挽救实验加强了氧化应激功能性作用的证据，但ROS生成、细胞能量状态变化、AMPK磷酸化与凋亡之间的精确因果关系仍有待确定。需要利用更多前列腺癌和正常前列腺细胞模型、对AMPK进行直接药理学或遗传学调控以及体内验证的进一步研究，以确定这些发现的更广泛生物学意义和潜在转化价值。