《International Journal of Molecular Sciences》：Physiological Responses to Chilling Stress and Transcriptome-Assisted Genome-Wide Characterization of the DREB Gene Family in Durian
编辑推荐：
榴莲对低温高度敏感，这限制了其在热带地区以外的种植。在本研究中，一年生‘猫山王’和‘金枕头’品种幼苗在10°C下处理7天，以表征其表型、生理和转录响应。研究人员评估了叶片表型、膜损伤、渗透调节、光合色素含量、淀粉酶活性和抗氧化酶活性，并在冷处理前以及处理后第1
榴莲对低温高度敏感，这限制了其在热带地区以外的种植。在本研究中，一年生‘猫山王’和‘金枕头’品种幼苗在10°C下处理7天，以表征其表型、生理和转录响应。研究人员评估了叶片表型、膜损伤、渗透调节、光合色素含量、淀粉酶活性和抗氧化酶活性，并在冷处理前以及处理后第1天和第5天采集样本进行转录组测序。‘金枕头’比‘猫山王’表现出更早且肉眼可见的更广泛的叶片脱落，而两个品种在丙二醛（MDA）积累和抗氧化酶活性方面呈现出对比性的时间模式。随后，比较转录组学分析被用于构建一个以‘猫山王’为中心的发现集，该集合包含基于渐进诱导模式和‘猫山王’中更高转录丰度优先排序的基因。由于AP2/ERF转录因子出现在该发现集中，因此在全基因组水平上对DREB基因家族进行了鉴定。共鉴定出81个DzDREB基因，并将其分为六个亚组。整合转录组响应模式、胁迫相关功能注释和启动子顺式调控元件，支持了一个由十个基因组成的DzDREB候选集用于进一步研究。探索性的季节性田间表达谱为其中七个候选基因提供了额外支持，其中DzDREB36、DzDREB45、DzDREB62和DzDREB66在不同数据集中显示出相对更强的支持。这些结果为深入研究榴莲冷胁迫响应的分子机制提供了候选资源。
榴莲冷胁迫响应机制及DREB基因家族的系统性研究解读
一、研究背景与研究目的
榴莲（Durio zibethinus）是一种典型的热带常绿果树，其最适生长温度为25-32°C，对低温极为敏感，这一特性严重制约了其向非热带地区的引种栽培。在中国，商业化的榴莲种植主要集中在海南岛南部，偶发的低温事件已成为限制幼苗定植、营养生长以及种植区域北扩的重要环境瓶颈。已有研究表明，不同榴莲品种在耐冷性上存在显著差异，例如在10°C处理下，‘猫山王’（Musang King）的综合耐冷性优于‘金枕头’（Monthong）。然而，关于榴莲幼苗在持续冷胁迫下的动态生理响应及其分子调控机制尚缺乏系统性认识。特别是，作为植物逆境响应核心调控因子的DREB（Dehydration Responsive Element Binding，脱水响应元件结合蛋白）转录因子家族，在榴莲中的全基因组鉴定与功能分析仍属空白。因此，本研究旨在通过比较两个耐冷性不同的榴莲品种在冷胁迫下的生理和转录组变化，系统鉴定并优先筛选出可能与品种间耐冷性差异相关的DzDREB基因，为后续功能验证提供靶点。该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
二、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法开展研究：
- 1.
受控冷胁迫处理与表型观察：将一年生的‘猫山王’和‘金枕头’幼苗置于10°C光照培养箱中进行为期7天的冷胁迫处理，并每日记录叶片表型变化。
- 2.
生理指标测定：分别测定了处理前后多个时间点的相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、渗透调节物质（脯氨酸、可溶性蛋白）、光合色素（叶绿素a/b）以及抗氧化酶（过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD、抗坏血酸过氧化物酶APX）和淀粉酶的活性。
- 3.
转录组测序（RNA-Seq）与分析：采集处理前（CK）及处理后第1天和第5天的叶片样本，对两个品种共计18个样本进行转录组测序，并通过差异表达分析和加权共表达网络构建，锁定以‘猫山王’为中心的候选基因集。
- 4.
全基因组生物信息学分析：利用BLASTP和HMM搜索从榴莲参考基因组中鉴定所有DREB家族成员，并进行系统发育、基因结构、保守基序、染色体定位、共线性分析以及启动子顺式作用元件分析。
- 5.
基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析：对鉴定的DzDREB基因进行功能注释和通路富集分析。
- 6.
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证：对筛选出的候选基因进行实验室条件下的表达验证，并利用来自海南保亭黎族苗族自治县同一果园的四个品种（‘猫山王’、‘金枕头’、‘Duri Hitam’和‘Kanyao’）的田间样本进行探索性季节性表达谱分析。
三、研究结果
3.1 叶片表型对冷胁迫的响应
通过每日视觉观察发现，‘金枕头’在处理第1天即出现叶片脱落，而‘猫山王’在第3天才观察到明显落叶。随着胁迫持续，两个品种的落叶均加重，但‘金枕头’的受害程度和速度均更为显著。这表明在实验条件下，‘金枕头’表现出更早且更严重的冷害症状。
3.2 膜损伤、渗透调节、色素含量及酶活性的变化
- •
膜损伤：两个品种的相对电导率（REC）均随冷处理时间延长呈上升趋势，表明细胞膜透性增加。值得注意的是，丙二醛（MDA）含量在两个品种中呈现截然不同的动态模式：‘猫山王’的MDA含量在早期上升后于第3天后下降，而‘金枕头’则持续升高至第7天达到峰值，反映出后者遭受了更持续的氧化膜脂损伤。
- •
渗透调节：脯氨酸含量在两个品种中均表现为早期（第3天）上升后下降的趋势。可溶性蛋白含量也均较对照有所增加，但‘猫山王’的高峰出现在第5天，晚于‘金枕头’的第3天。
- •
光合色素：叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在处理第1天短暂下降后，随后又呈现回升趋势。研究人员指出，这种后期回升可能是由于叶片失水导致的浓度效应以及严重受损叶片脱落后的采样偏差所致，而非真正的生理恢复。
- •
酶活性：两个品种的抗氧化酶活性模式迥异。在‘猫山王’中，过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性均在冷处理早期（约第3天）达到峰值后下降，表现出协同的早期抗氧化响应。而在‘金枕头’中，CAT活性持续下降，POD活性却持续上升至第7天。淀粉酶活性在两个品种中均随处理时间延长而持续增强。
3.3 比较转录组分析与‘猫山王’中心发现集的构建
通过对18个样本的转录组测序（共获得109.17 Gb原始数据），研究人员采用严格的筛选标准：首先筛选出在‘猫山王’中从对照到第1天、再到第5天均显著上调的基因，并排除在‘金枕头’中也符合此模式的基因，得到2662个基因。同时，筛选出在第1天和第5天均在‘猫山王’中表达量高于‘金枕头’的984个基因。两者取交集，最终得到一个包含331个基因的‘猫山王’中心发现集。对该基因集的注释显示，其中富含编码晚期胚胎发生丰富蛋白、热激蛋白以及包括AP2/ERF在内的多种转录因子家族的基因，这为后续聚焦DREB家族提供了依据。
3.4 榴莲DREB基因家族的鉴定与表达分析
研究人员在全基因组水平上鉴定了81个DzDREB基因，并根据与拟南芥的系统发育关系将其划分为A-1至A-6六个亚组，其中A-4亚组成员最多（33个）。理化性质分析表明，大多数DzDREB蛋白为亲水性、不稳定性蛋白，且预测定位于细胞核。基因结构和保守基序分析显示，同一亚组的成员具有相似的组成模式。启动子分析发现，脱落酸（ABA）响应元件（ABRE）广泛存在于67个DzDREB基因的启动子中，而经典的DRE元件仅存在于1个基因的启动子中，提示ABA信号可能在DzDREB基因的上游调控中发挥重要作用。共线性分析揭示了92对种内共线性关系和119对榴莲与拟南芥之间的种间共线性关系，表明该家族在进化上较为保守。
3.5 候选基因优先级排序与田间表达谱分析
通过综合三个维度的证据——（i）受控冷胁迫下的表达模式，（ii）与胁迫相关的GO注释（如“对冷的响应”），以及（iii）启动子中胁迫相关顺式元件的分布，研究人员优先筛选出一个由10个基因组成的候选集：DzDREB6, DzDREB7, DzDREB25, DzDREB36, DzDREB42, DzDREB45, DzDREB48, DzDREB57, DzDREB62和DzDREB66。进一步的探索性季节性田间表达谱分析显示，在‘猫山王’中，有7个基因（DzDREB6, DzDREB36, DzDREB42, DzDREB45, DzDREB57, DzDREB62和DzDREB66）在一月份（冬季）的表达量显著高于十月份（秋季）。其中，DzDREB36, DzDREB45, DzDREB62和DzDREB66因其在受控实验中也表现出渐进性诱导，获得了跨数据集的最强支持。
四、讨论与结论
讨论部分总结：本研究的讨论部分首先指出，‘金枕头’更早的落叶和持续升高的MDA水平，与先前报道的‘猫山王’耐冷性更强一致，为品种间差异提供了生理学证据。其次，对于叶绿素含量的后期回升，研究人员谨慎地将其归因于叶片失水和落叶造成的浓度效应，而非生理恢复。再次，两个品种在抗氧化酶活性上的差异模式表明，‘猫山王’更有效的早期抗氧化响应是其应对冷胁迫的关键。最后，针对DREB家族的分析，研究人员强调了ABRE元件的广泛分布和DRE元件的稀缺性，暗示了ABA信号在调控DzDREB基因表达中的潜在主导地位，并指出筛选出的候选基因中包含了经典A-1亚组之外的成员，提示榴莲的冷响应可能涉及更广泛的DREB调控网络。
研究结论翻译：本研究描述了榴莲幼苗在持续冷胁迫下的表型、生理和转录响应，并对DzDREB家族进行了全基因组分析。与先前报道的‘猫山王’耐冷性强于‘金枕头’一致，‘金枕头’表现出更早且更广泛的叶片脱落，而两个品种在丙二醛（MDA）积累和抗氧化酶活性方面呈现出对比性的时间模式。一项假设驱动的、以‘猫山王’为中心的转录组策略产生了一个由331个基因组成的发现集，其特征是在‘猫山王’中具有渐进性诱导和优先表达的转录本丰度。随后的全基因组分析鉴定出81个DzDREB基因，分为六个亚组。整合家族范围的转录组响应模式、胁迫相关功能注释和启动子顺式调控元件，支持了一个由十个基因组成的DzDREB候选集的优先排序。探索性的季节性田间表达谱为十个优先候选基因中的七个提供了额外支持，其中DzDREB36、DzDREB45、DzDREB62和DzDREB66显示了相对更强的跨数据集表达支持。这些基因代表了未来旨在阐明榴莲差异化冷响应分子基础的功能研究的优先候选对象。
