《International Journal of Molecular Sciences》：Beyond Shedding: Conserved Retention of ZAN After the Acrosome Reaction Across Rabbit, Boar, and Bull Sperm
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Zonadhesin（ZAN）是一种精子蛋白，目前已知其介导与卵母细胞透明带（zona pellucida，ZP）的结合。尽管其定位已在来自小鼠、猪和兔的精子和获能精子中有所描述，但其在顶体反应后的分布仍知之甚少。在此，研究人员在模拟早期受精事件的体外条件下，
Zonadhesin（ZAN）是一种精子蛋白，目前已知其介导与卵母细胞透明带（zona pellucida，ZP）的结合。尽管其定位已在来自小鼠、猪和兔的精子和获能精子中有所描述，但其在顶体反应后的分布仍知之甚少。在此，研究人员在模拟早期受精事件的体外条件下，表征了ZAN在兔、猪和牛精子中的定位。研究人员分析了射出精子、在获能培养基中经上游法（swim-up）筛选的精子以及经顶体反应诱导处理的精子。研究人员使用靶向ZAN中一个与先前研究结构域不同的结构域的抗体进行了免疫荧光检测，并结合PNA-FITC以评估顶体状态；通过定量液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）评估蛋白质丰度。ZAN主要检测于未反应精子的前部区域，与既往报道一致，但该独特表位也揭示了顶体后区的定位。在未反应精子中观察到物种特异性模式，而在顶体反应后，ZAN在顶体后区被一致检测到。这些发现确定了ZAN一个先前未被识别的顶体后区分布，并提示这可能不仅有助于精子与透明带的结合，还可能参与受精的后期阶段，包括精子与卵胞膜（oolemma）的相互作用及膜融合。
论文解读：ZAN蛋白在哺乳动物精子顶体反应后的保守保留及其在受精后期潜在作用
一、研究背景与目的
在哺乳动物受精过程中，精子与卵母细胞透明带（zona pellucida，ZP）的识别与结合是决定受精成败的关键早期事件之一。Zonadhesin（ZAN）是一种最早从猪精子中分离鉴定的高分子量精子蛋白，分子量约为300–350 kDa，属于镶嵌蛋白，含MAM型结构域（meprin/A5抗原/酪氨酸磷酸酶μ受体）、黏蛋白样结构域、血管性血友病因子同源D结构域及表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）结构域。ZAN已被证实广泛存在于猪、小鼠、人类、兔和仓鼠等多个哺乳动物物种中，其MAM型结构域在物种间高度保守，四个保守半胱氨酸残基及疏水/芳香族残基对维持其结构及潜在的黏附功能至关重要。既往研究表明，ZAN主要定位于精子顶体外膜，参与精子与ZP的初级识别与结合。然而，ZAN在顶体反应后的命运及其分布变化长期缺乏系统研究。尽管已有研究在猪和仓鼠中通过电子显微镜观察到ZAN在精子发生过程中的定位，但其在获能和顶体反应过程中的动态重分布仍不明确。此外，ZAN是否在顶体反应后被保留并参与精子–卵母细胞融合等受精后期事件，尚缺乏直接证据。为此，本研究采用兔、猪和牛三种系统发育上具有代表性的哺乳动物物种，在模拟早期受精事件的体外条件下，系统比较了ZAN在射出精子、获能筛选精子和顶体反应诱导后的定位变化，旨在阐明ZAN在受精各阶段的保守性分布模式及其潜在功能意义。
二、研究方法概述
研究人员选取兔（新西兰白兔，n=7）、猪（皮特兰猪，Axiom Genetics品系，n=7）和牛（利穆赞牛，冻精，n=6）三种物种的精液样本，设置三种实验条件：射出精子（ejaculated，E）、经获能培养基上游法（swim-up）筛选的精子（selected，S）以及经钙离子载体A23187诱导顶体反应的精子（acrosome-reacted，AR）。采用针对ZAN蛋白MAM区域（而非先前研究的“活性”D0–D3区域）的兔多克隆抗体进行免疫荧光染色，并结合花生凝集素-异硫氰酸荧光素（PNA-FITC）双重标记以评估顶体状态，使用共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 800）对各条件下至少200个精子进行成像分析。同时，对每个物种各条件下6个随机选择的个体样本进行定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析，以量化ZAN蛋白丰度变化。统计分析采用SPSS 28.0软件，根据数据正态性和方差齐性分别选用Student's t检验、Welch's t检验、Mann–Whitney U检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal–Wallis检验。
三、研究结果
3.1 顶体状态评估
通过PNA-FITC标记，研究人员将顶体区域显示绿色荧光的精子判定为未反应，而标记仅限于赤道区或无顶体标记的精子判定为已反应。结果显示，兔和牛精子中射出组与获能筛选组的自发顶体反应率无显著差异（兔：E 10.23% vs. S 28.95%；牛：E 1.83% vs. S 3.17%），而猪精子在筛选后自发顶体反应率显著升高（E 4.00% vs. S 22.83%，p < 0.01）。三种物种中，诱导顶体反应组的顶体反应率均较射出组显著增加（E vs. AR，p < 0.01）。
3.2 兔精子中透化处理揭示顶体后区ZAN定位
在兔精子中观察到五种ZAN染色模式：模式1为顶体嵴和赤道前亚结构域斑点状染色；模式2为顶体嵴和赤道前亚结构域强染色伴顶体后区斑点状染色；模式3为赤道膨突和顶体后区染色；模式4仅顶体后区染色；模式5无标记。经获能培养基上游法筛选后，模式3（赤道膨突和顶体后区同时定位）的精子比例从0.99%显著增加至17.59%（Mann–Whitney U检验，p = 0.001），其余模式无显著变化。
3.3 猪精子获能筛选过程中ZAN模式的动态重塑
猪精子中观察到四种ZAN定位模式，与IZUMO1蛋白的分布模式相似但相对丰度不同。获能筛选显著改变了各模式的相对分布（各模式均p < 0.05）。具体而言，顶体嵴强染色伴赤道前亚结构域和顶体后区斑点状染色的精子比例从84.54%显著降至11.63%（Student's t检验，p < 0.001）；而仅顶体后区斑点状染色的精子比例从1.64%显著增至14.70%（p < 0.001）；赤道前亚结构域和顶体后区标记的精子比例从11.46%显著增至65.54%（Welch's t检验，p < 0.001）；无标记的精子比例从2.36%增至8.13%（p = 0.038）。
3.4 牛精子获能筛选增强顶体区ZAN定位
牛精子中观察到四种模式：模式1为顶体嵴和赤道前亚结构域斑点状染色；模式2为顶体嵴和赤道前亚结构域强染色伴顶体后区斑点状染色；模式3仅顶体后区染色；模式4无标记。获能筛选后，模式1的精子比例从4.21%显著增至19.55%（Welch's t检验，p < 0.001），其余模式无显著差异。
3.5 ZAN在哺乳动物精子顶体反应后的保守保留
仅分析经PNA-FITC确认的顶体反应精子，发现ZAN在三种物种的部分顶体反应精子中不可检测（兔33.62%、猪16.30%、牛53.14%），但在保留ZAN的精子中，其定位主要集中于顶体后区（兔66.38%、猪83.70%、牛46.86%）。值得注意的是，兔精子中38.7%还显示赤道膨突标记（模式3）。三种物种的顶体反应精子中均未检测到模式1和模式2。
3.6 ZAN蛋白的定量分析
LC-MS/MS定量结果显示，ZAN在三种物种的所有实验条件下均可检测到。兔和猪精子各条件下ZAN丰度无显著差异（one-way ANOVA，p > 0.05），但猪精子显示非显著趋势（p = 0.065）。牛精子中，ZAN丰度从射出精子的253,020.00显著增至筛选后的287,136.00（Bonferroni校正，p < 0.01），并在顶体反应诱导后显著降至236,566.00（p < 0.01）。
四、讨论与结论
本研究通过多物种比较框架，利用靶向MAM区域的抗体首次系统揭示了ZAN在顶体反应后的保守保留现象。与既往研究一致，ZAN在未反应精子中主要定位于前部区域，但新抗体还揭示了其顶体后区分布。物种特异性模式在未反应精子中表现明显，而顶体反应后三种物种均一致地显示ZAN保留于顶体后区，这表明ZAN并非在顶体胞吐过程中完全丢失，而是与参与受精后期阶段的膜结构域保持关联。ZAN在顶体后区和赤道膨突的持续存在，以及猪精子中观察到的ZAN不对称分布（限于顶体后区一侧），与精子头的背腹极化特征一致，提示ZAN可能参与精子浆膜与卵胞膜之间的定向相互作用，在配子结合和/或融合中发挥作用。定量蛋白质组学数据进一步支持了荧光结果，顶体反应后ZAN丰度的降低可能反映了蛋白质的重分布或释放。该研究首次建立了ZAN在受精过程中的时空分布模型，为深入阐明ZAN在受精后期事件中的功能意义提供了概念框架，也为理解哺乳动物受精的分子机制提供了新的视角。该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
