利用可见飞秒激光脉冲进行滋养外胚层活检的安全性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Studying the Safety of Trophectoderm Biopsy Using Visible Femtosecond Laser Pulses

　　

摘要：激光辅助的滋养外胚层（TE）活检通常使用毫秒二极管激光器进行，其热效应仍然是主要的安全问题。飞秒激光提供了根本不同的相互作用机制，但其用于TE活检的安全性尚未被评估。本研究旨在评估飞秒激光作为CD1小鼠囊胚TE活检工具的潜力。研究人员使用波长514 nm、峰值强度为5.3–16 TW/cm2的单脉冲进行活检。量化了分离不同峡部宽度的TE样本所需的脉冲数量。生物效应的研究包括活性氧（ROS）和热休克蛋白（HSP70）。在16 TW/cm2下的激光暴露能够在临床相关的脉冲数内实现高效的TE活检，且不增加ROS水平，仅引起有限的HSP70升高，这与适应性应激反应一致。共有417枚胚胎被移植到假孕雌鼠体内，以评估着床和发育结局。活检组与未暴露的对照组囊胚之间的着床率（25.8% vs. 29.6%）以及发育结局（正常胚胎、发育迟缓和吸收）的分布均无显著差异。这支持进一步评估飞秒光源作为植入前遗传学检测程序工具的可行性。

飞秒激光用于滋养外胚层活检的安全性研究：一项基于小鼠模型的系统评估

1. 研究背景与问题

在辅助生殖技术（ART）项目中，于囊胚期进行的植入前遗传学检测（PGT）结合滋养外胚层（TE）细胞活检已成为减少种植失败和自然流产的标准方法。尽管从卵裂球活检过渡到TE活检提高了分析的可靠性与安全性，但活检本身涉及的多个技术步骤（如辅助孵化、细胞抽吸和样本分离）仍可能影响胚胎及围产期结局。目前临床上广泛采用毫秒级半导体激光器（典型参数：脉宽≥0.6 ms，功率约250 mW，光斑直径约3 μm，波长1480 nm）进行激光辅助孵化（LAH）和TE活检。然而，这类激光的主要隐患在于其热效应——研究表明在某些条件下，光斑中心温度可达数百度，且加热区域会超出激光光斑的几何尺寸，这可能增加胚胎嵌合体发生率并对胚胎造成潜在损伤。

飞秒激光因其极短的脉冲持续时间、高峰值功率以及以光致破裂为主的相互作用机制（横向热扩散极小），被视为毫秒系统的理想替代方案。理论上，飞秒激光能够在透明带（ZP）上形成宽度仅为微米级的精细切口，从而减少活检过程中的附带损伤。然而，相较于经过临床验证的毫秒激光系统，关于飞秒脉冲用于TE活检的研究明显不足，尤其是缺乏对显微手术效率（即分离给定峡部宽度所需脉冲数）、早期细胞应激反应以及长期生殖结局的系统性评估。

因此，本研究旨在弥补这一空白，通过在小鼠囊胚模型中整合评估可见光飞秒激光TE活检的显微手术效率和生物学安全性，为未来将该技术转化至临床PGT实践奠定基础。

2. 主要关键技术方法

研究人员使用自主研发的飞秒激光显微手术平台（集成于Olympus IX-71倒置显微镜），以波长514 nm、脉宽280 fs、重复频率2.5 kHz的二次谐波辐射进行胚胎显微手术。采用20倍物镜（数值孔径0.5）聚焦，焦斑半径约1.4 μm（1/e水平）。实验动物为远交系CD1（ICR）小鼠，共获取836枚E3.5期胚胎。对于未发生自然孵化的囊胚，先以2.5 TW/cm²强度的飞秒激光序列进行LAH。随后，在单脉冲模式下（强度范围5.3–16 TW/cm²）进行TE活检，分离含约5个细胞的活检样本。生物效应评估包括：以CM-H2DCFDA探针检测活性氧（ROS）水平，以免疫荧光染色检测热休克蛋白HSP70表达，并以碘化丙啶（PI）染色鉴定死细胞。最终将417枚胚胎移植至假孕雌鼠子宫角，在E16.5–E18.5阶段解剖分析着床及发育结局。

3. 研究结果

3.1 激光辅助孵化

当需要进行LAH时，研究人员用固定管在靠近内细胞团（ICM）一侧的ZP处固定胚胎。通过预设的激光束轨迹进行微手术，实现ZP变薄或开口，以便活检针进入抽吸TE细胞。

3.2 TE细胞活检

在捕获TE细胞并施加张力后，操作者选择位点进行激光曝光。每次曝光后若未完全切断，则将曝光点向远离边缘方向移动，重复操作直至整个峡部被切断。整个过程中，邻近TE细胞未见膜起泡或胞质局部暗化/混浊等急性细胞毒性或热损伤的视觉表现。活检后囊胚通常会塌陷，但在数小时内可重新扩张，共聚焦显微镜检查未发现异常。PI染色显示无广泛细胞死亡。

3.3 不同飞秒脉冲强度下TE细胞活检效率评估

研究测试了5.3、6.6、8.4、12和16 TW/cm²五种峰值强度。结果显示，峡部宽度D是决定所需单脉冲数N的关键几何参数。线性模型交互项分析表明，D与I的交互作用显著（p ≈ 3.4 × 10^?6），即N(D)曲线的斜率随强度变化。在5.3 TW/cm²阈值附近，需精确三维定位（距边缘约1 μm），最小峡部（~6 μm）也需4–6个脉冲，效率较低。随着强度增加，所需脉冲数减少：8 TW/cm²时最小峡部需2–3个脉冲；16 TW/cm²时单个脉冲即可分离最窄峡部，并可一次切断宽达12–15 μm的峡部。因此，12和16 TW/cm²被认为是更优的选择。

3.4 TE细胞活检后胚胎细胞内ROS水平评估

研究人员选择12和16 TW/cm²两个强度，对峡部宽度约5–8 μm的样本各施以2个脉冲，以避免脉冲数与峰值强度的混杂效应。定量分析显示，两个实验组的ROS水平与阴性对照组无统计学显著差异（Mann–Whitney U检验，Bonferroni校正）。阳性对照组则表现出显著的信号增强。结果表明，即使使用最大强度，激光暴露也不会增加ROS水平。

3.5 TE细胞活检后胚胎细胞内热休克蛋白表达水平评估

同样在12和16 TW/cm²下各施以2个脉冲，HSP70荧光强度分析显示，实验组的HSP70产量相对于阴性对照组有所增加，且较高强度（E2组）的反应更强。所有比较的Cliff's delta值接近1.0，表明效应量较大。这表明激光暴露触发了适应性应激反应，而非直接的细胞毒性损伤。

3.6 TE活检后胚胎着床研究

选取最坏情况（16 TW/cm²）进行移植实验。实验组总着床率为25.79%（57/221），对照组为29.59%（58/196），风险差为?3.80个百分点（95% CI: ?12.41至+4.81），相对风险RR=0.87（95% CI: 0.64至1.18），比值比OR=0.83（95% CI: 0.54至1.27），均未显示统计显著性。正常胚胎、发育迟缓胚胎和吸收的发生率在两组间也无显著差异。

3.7 脉冲强度I=16 TW/cm²时的活检效率评估

基于大规模数据集（N=221次活检）的线性回归分析显示，N与D呈显著正相关（斜率a=0.0996，p=6.0×10^?7）。模型预测：最窄峡部约需1个脉冲，峡部宽度每增加约10 μm，脉冲数增加约1个。对于20 μm宽的峡部，预期平均脉冲数约为3.4个（95%预测区间约1–5个）。模型解释了约33%的变异，残余散射归因于样本预张力、激光能量波动及囊胚质量等因素。

4. 讨论与结论

讨论部分总结： 研究人员指出，本研究首次在同一实验模型中建立了连接峡部几何形状、脉冲强度、活检效率、细胞应激反应和着床结局的综合定量框架。物理机制方面，飞秒激光的光致破裂在亚微米至微米级等离子体体积内产生极高温度和压力，但大部分能量通过空化气泡膨胀和冲击波发射以机械功形式释放，而非转化为持续的体加热，这与毫秒激光的热扩散模式截然不同，解释了观察到的有限热损伤。分子标志物方面，ROS无升高而HSP70呈剂量依赖性适度增加，表明这是一种适应性保护反应而非致命损伤。着床数据进一步证实，在最恶劣条件（16 TW/cm²）下，活检并未导致统计学显著的着床率下降。与临床毫秒激光系统相比，本研究中飞秒激光在典型峡部宽度（10–20 μm）下所需的预期平均脉冲数相当或更低（通常2–4个脉冲），且同时具备无ROS升高、有限的HSP70反应和保存完好的着床能力等优势。研究局限性包括样本量有限、缺乏与毫秒激光的直接匹配对比、缺乏针对具体参数的数值模拟以及未包含未染色对照等。结论需在人类胚胎上进一步验证。

结论部分翻译： 研究表明，在12–16 TW/cm²强度下对小鼠囊胚滋养外胚层细胞进行飞秒激光活检，能够在技术效率和可接受的安全性之间取得平衡。脉冲数随峡部宽度的线性依赖关系表明，在有限的操作时间和最小化的总能量输入条件下，此类活检具有实际可行性。大多数手术只需2–4个脉冲即可完成，即使是相对较宽的峡部（约20–30 μm）。与阴性对照组相比，ROS水平未见升高，HSP70表达仅有有限升高，并且着床率和妊娠结局结构与对照组持平，这表明所采用的飞秒模式不会造成显著的热损伤或致死性损伤，而是主要触发了一种不会导致生殖结局明显恶化的适应性应激反应。在12–16 TW/cm²范围内，16 TW/cm²在效率和安全性之间提供了最佳整体平衡：它最大限度地减少了宽峡部的脉冲数和总暴露时间，不升高ROS，并且是在全生物体层面直接确认无统计学显著着床恶化的特定条件。因此，HSP70随强度增加的剂量依赖性上升反映了一种比例性的适应性反应，而非测试范围内的安全隐患。综合来看，这些结果为飞秒TE活检建立了一个定量且经生物学验证的操作框架，为进一步优化该技术以及在匹配实验条件下与毫秒激光方案进行严格头对头比较提供了基础。