瑞士乳杆菌HY7804减轻慢性狂饮乙醇喂养小鼠模型中乙醇诱导的肝损伤并调节氧化应激与炎症反应

《International Journal of Molecular Sciences》：Lactobacillus helveticus HY7804 Alleviates Ethanol-Induced Liver Injury and Modulates Oxidative Stress and Inflammatory Responses in a Chronic-Binge Ethanol-Fed Mouse Model

　　

酒精相关性肝病（Alcohol-associated liver disease，ALD）对全球慢性肝病负担有重要影响，但目前有效的药物治疗手段十分有限。研究人员在乙醇暴露的HepG2细胞以及基于美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism，NIAAA）范式改良的慢性狂饮乙醇喂养小鼠模型中，评估了瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）HY7804的肝保护潜力。HY7804可减轻乙醇诱导的HepG2细胞细胞毒性，表现为细胞活力恢复和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放减少。HY7804还降低了乙醇诱导的炎症细胞因子产生，包括白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-8（IL-8），并调节了凋亡相关基因表达。在慢性狂饮乙醇喂养小鼠中，HY7804使血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）从183.4 ± 34.1 U/L降至129.4 ± 16.4 U/L（p < 0.01），丙氨酸氨基转移酶（ALT）从67.5 ± 4.5 U/L降至52.1 ± 4.7 U/L（p < 0.05）。与EtOH组相比，HY7804处理还显著减少了肝脏脂质蓄积，油红O阳性面积显著降低（p < 0.01）。肝脏丙二醛（MDA）水平从46.01 ± 3.38 nmol/mg组织降至30.58 ± 6.38 nmol/mg组织（p < 0.01）。此外，HY7804调节了肝脏炎症细胞因子谱、抗氧化相关反应以及Bax/Bcl-2表达比率。这些发现表明，HY7804可减轻乙醇诱导的肝脏损伤，并伴随炎症反应、抗氧化相关标志物、脂质过氧化和凋亡相关基因表达的变化。

# 论文解读：瑞士乳杆菌HY7804在慢性狂饮乙醇喂养小鼠模型中的肝保护作用及机制研究

## 研究背景与目的

酒精相关性肝病（Alcohol-associated liver disease，ALD）是全球慢性肝病的主要病因之一，涵盖从单纯性脂肪变性到酒精相关性脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化乃至肝衰竭的一系列肝脏疾病。流行病学数据显示，ALD在普通人群中的患病率约为3.5%，在有害饮酒者中达26.0%，在酒精使用障碍个体中高达55.1%，疾病负担极为突出。目前，戒酒仍是预防ALD进展最有效的策略，但有效的药物干预手段十分有限，临床管理主要依赖戒酒和支持治疗。因此，针对酒精性肝损伤多因素发病机制的新型预防或辅助干预策略具有迫切需求。

乙醇诱导的肝损伤与酒精代谢引起的氧化还原失衡和炎症反应失调密切相关。乙醇经细胞色素P450 2E1（CYP2E1）代谢产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），导致肝脏氧化应激、抗氧化防御受损、脂质过氧化以及细胞大分子氧化损伤。氧化应激还可影响Nrf2/HO-1介导的抗氧化反应，并激活NF-κB相关信号通路，促进肝脏促炎细胞因子产生。因此，恢复氧化还原平衡并抑制过度炎症反应可能成为预防酒精性肝损伤的可行策略。

益生菌被定义为摄入足够量时对宿主健康有益的活性微生物。瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）是一种革兰氏阳性、嗜热、同型发酵乳酸菌，传统上用作乳制品发酵的起始或辅助菌种。该菌种的多株菌株已被报道具有宿主免疫调节、抑制病原体及肠道菌群相关效应等多种促进健康的特性。瑞士乳杆菌HY7804最初从生鲜牛乳中分离获得，此前已在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）实验模型中显示出改善肝损伤标志物、减轻肝脏脂肪变性和降低肝损伤组织病理学特征的作用，并伴随肠道屏障功能、肠道炎症和肠道菌群组成的变化。然而，HY7804在乙醇诱导肝损伤中的保护作用此前尚未被研究。鉴于氧化应激、炎症激活和脂质代谢紊乱是代谢性肝损伤与酒精性肝损伤共通的病理特征，研究人员假设HY7804可能通过调节乙醇暴露相关的关键病理反应来减轻乙醇诱导的肝损伤，并利用HepG2细胞乙醇暴露模型和基于NIAAA范式的慢性狂饮乙醇喂养小鼠模型对此进行了验证。

## 关键技术方法

研究人员采用体外与体内相结合的实验体系。体外实验使用人肝细胞癌细胞系HepG2（购自韩国细胞系库），以750 mM乙醇处理48小时建立乙醇损伤模型，通过MTT法检测细胞活力、LDH释放评价细胞毒性，ELISA检测培养上清中IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α水平，qPCR检测CASP3和CASP9表达。体内实验采用8周龄雌性C57BL/6小鼠（购自Dooyeol Biotech），随机分为5组（n=6）：正常对照组（NOR）、乙醇喂养组（EtOH）、水飞蓟素阳性对照组（EtOH + SM，100 mg/kg/天）、瑞士乳杆菌标准菌株ATCC15009处理组（EtOH + TH，10⁹ CFU/kg/天）和HY7804处理组（EtOH + HY，10⁹ CFU/kg/天）。乙醇组采用Lieber-DeCarli乙醇液体饲料逐步适应后以5%乙醇维持10天，第16天单次灌胃乙醇（5 g/kg）建立慢性狂饮模型。检测指标包括血清AST/ALT、肝脏H&E染色与油红O染色组织病理学分析、肝脏抗氧化酶（过氧化氢酶、SOD）活性、MDA含量、ELISA检测肝脏细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10），qPCR检测肝脏抗氧化基因（Cat、Sod1、Sod2、Gpx1、Hmox1、Nfe2l2、Gclc）和凋亡相关基因（Bax、Bcl-2）表达。

## 研究结果

### 2.1 HY7804对细胞毒性的影响

在HepG2细胞中，10⁵–10⁷ CFU/mL的HY7804单独处理未降低细胞活力（102.33%–112.41%）。乙醇处理使细胞活力显著降至33.27%（p < 0.001），而HY7804预处理以剂量依赖方式提高细胞活力至37.75%（无统计学意义）、46.70%（p < 0.01）和53.35%（p < 0.001），并显著降低乙醇诱导的LDH释放（p < 0.001）。细菌单独对照显示HY7804本身对MTT甲臜形成贡献可忽略不计。

### 2.2 HY7804对HepG2细胞促炎细胞因子分泌的影响

乙醇处理显著升高HepG2细胞IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α分泌水平。HY7804预处理（10⁵–10⁷ CFU/mL）显著抑制IL-6和IL-1β水平，IL-8在10⁷ CFU/mL时显著降低（p < 0.05），TNF-α在各浓度下均降低。

### 2.3 HY7804对HepG2细胞凋亡相关基因表达的影响

乙醇处理使CASP3和CASP9 mRNA表达分别显著增加1.31倍和1.42倍（p < 0.001）。HY7804在10⁶和10⁷ CFU/mL浓度下显著降低CASP3表达，各浓度均显著降低CASP9表达。

### 2.4 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠生理参数、器官重量和血清肝损伤标志物的影响

乙醇喂养显著增加肝脏重量和肝体比（p < 0.001），水飞蓟素、ATCC15009和HY7804处理均显著降低这些参数（p < 0.001）。HY7804显著降低血清AST（p < 0.01）和ALT（p < 0.05）水平，水飞蓟素也显著降低两者（p < 0.05和p < 0.001），而ATCC15009组仅呈数值下降趋势。

### 2.5 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝脏组织病理学变化和脂质蓄积的影响

大体观察显示乙醇喂养导致肝脏体积增大，各处理组肉眼可见肝脏增大减轻。H&E染色显示EtOH组出现肝细胞空泡化和脂肪变性，HY7804处理组肝组织形态改善。油红O染色定量分析显示，乙醇喂养显著增加肝脏脂质沉积（p < 0.01），HY7804显著减少油红O阳性面积（p < 0.01）。

### 2.6 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝脏抗氧化防御和脂质过氧化的影响

乙醇喂养降低肝脏Cat、Sod1和Sod2 mRNA表达（Cat和Sod2差异显著，p < 0.05），HY7804显著恢复三者表达（Cat，p < 0.001；Sod1和Sod2，p < 0.01）。乙醇喂养显著降低过氧化氢酶和SOD活性（p < 0.001），HY7804显著升高SOD活性（p < 0.05），过氧化氢酶活性亦见升高。乙醇组肝脏MDA水平较正常组显著升高（46.01 ± 3.38 vs. 27.02 ± 5.05 nmol/mg组织，p < 0.001），HY7804显著降低MDA至30.58 ± 6.38 nmol/mg组织（p < 0.05）。

### 2.7 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝脏Nrf2相关抗氧化基因表达的影响

乙醇喂养显著下调肝脏Nfe2l2和Gclc表达（p < 0.01），Hmox1呈下降趋势。HY7804显著增加Hmox1（p < 0.01）、Nfe2l2（p < 0.05）和Gclc（p < 0.05）表达，ATCC15009也显著恢复Gclc表达（p < 0.05）。

### 2.8 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝脏炎症细胞因子水平的影响

乙醇喂养显著升高肝脏IL-6、TNF-α和IL-1β水平（p < 0.001）。水飞蓟素、ATCC15009和HY7804处理均显著降低IL-6和TNF-α（p < 0.001）；水飞蓟素和HY7804显著降低IL-1β（p < 0.05）。IL-17无显著组间差异但EtOH组呈升高趋势。HY7804显著增加抗炎细胞因子IL-10水平（p < 0.01）。

### 2.9 HY7804对慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝脏凋亡相关基因表达的影响

乙醇喂养显著升高肝脏Bax表达（p < 0.001）并降低Bcl-2表达（p < 0.05），导致Bax/Bcl-2比率显著升高（p < 0.001）。水飞蓟素显著降低Bax表达（p < 0.001），水蓟素和HY7804均显著降低Bax/Bcl-2比率（p < 0.01）。研究人员指出，这些转录水平变化尚不足以确定HY7804对肝细胞凋亡的直接效应。

## 讨论与结论

研究结果表明，HY7804在体外可减轻乙醇诱导的HepG2细胞毒性、炎症细胞因子分泌和凋亡相关基因上调；在体内可降低血清转氨酶、减轻肝脏脂质蓄积和组织病理学损伤，恢复抗氧化酶表达和活性，降低脂质过氧化，恢复Nrf2相关抗氧化基因表达，降低促炎细胞因子并增加IL-10，同时改善Bax/Bcl-2表达比率失衡。这些效应共同支持HY7804作为功能性益生菌成分在缓解乙醇相关肝损伤方面的潜在应用价值。但研究未检测Nrf2相关通路和凋亡通路的蛋白水平变化，也未评估肠道屏障功能、肠道菌群组成或内毒素相关反应，未来需进一步研究肠道-肝脏轴参与机制以及HY7804来源的生物活性代谢物或菌株特异性功能成分。

研究结论为：总体而言，研究结果支持瑞士乳杆菌HY7804对HepG2细胞中乙醇相关细胞损伤和慢性狂饮乙醇喂养小鼠肝损伤的保护作用。HY7804改善了乙醇相关的细胞损伤、血清转氨酶升高、肝脏脂质沉积和组织病理学异常。这些保护作用伴随着肝脏炎症反应减轻、抗氧化相关反应改善、脂质过氧化降低以及凋亡相关基因表达的调节。综上所述，本研究凸显了HY7804作为酒精相关肝脏健康潜在益生菌材料的价值，同时需要进一步研究来确定其活性成分并阐明其转化意义。